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Peroxiredoxin 6对细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的作用及机制重研究

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内容提示: 复旦大学博士学位论文Peroxiredoxin 6对细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的作用及机制研究姓名:杨冬申请学位级别:博士专业:内科学(呼吸病学)指导教师:白春学200904 博士学位论文中文摘要第一部分Peroxi redoxi n6减轻细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的抗氧化作用目的:Pcroxi redoxi n(Prdx)6是非硒基依赖性过氧化物酶,有抗氧化作用。本研究旨在探讨Prdx6在细菌脂多糖(LPS)诱发小鼠急性肺损伤中的抗氧化作用。方法:本实验应用雄性Prdx6基因敲除小鼠和同基因背景的C57BL/6J 野生型小鼠,原代培养肺泡和腹腔巨噬细胞,测定巨噬细胞内活性氧簇(I的S)水平;以LPS5m g/kg气管滴入...

文档格式:PDF| 浏览次数:32| 上传日期:2015-06-17 22:24:20| 文档星级:
复旦大学博士学位论文Peroxiredoxin 6对细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的作用及机制研究姓名:杨冬申请学位级别:博士专业:内科学(呼吸病学)指导教师:白春学200904 博士学位论文中文摘要第一部分Peroxi redoxi n6减轻细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的抗氧化作用目的:Pcroxi redoxi n(Prdx)6是非硒基依赖性过氧化物酶,有抗氧化作用。本研究旨在探讨Prdx6在细菌脂多糖(LPS)诱发小鼠急性肺损伤中的抗氧化作用。方法:本实验应用雄性Prdx6基因敲除小鼠和同基因背景的C57BL/6J 野生型小鼠,原代培养肺泡和腹腔巨噬细胞,测定巨噬细胞内活性氧簇(I的S)水平;以LPS5m g/kg气管滴入制备急性肺损伤模型,用药后4小时检测肺脏病理,湿/干比、支气管肺泡灌洗液(BALF)内蛋白浓度、肺脏髓过氧化物酶(ⅧO )活性,过氧化氢( H 202) 、丙二醛( M DA) 、蛋白羰基、总超氧化物歧化酶( T.SO D)活力和总抗氧化能力( TAO C) 。结果:Prdx6基因敲除小鼠巨噬细胞内RO S含量较C57BL/6J 明显增高,经LPS刺激后升高更为显著。气管滴入LPS后诱导小鼠急性肺损伤:与载体组对比,LPS组病理出现炎症表现,湿/干比及BALF内蛋白浓度增加,M PO 活性增加,H 202和M D A含量增加,T.SO D 活力和TAO C降低。Prdx6基因敲除小鼠较C57BL/6J 小鼠损伤更为严重并伴有蛋白羰基化水平的增高。结论:Prdx6基因缺失通过增加RO S的表达,加重脂质和蛋白氧化从而使LPS诱发的肺损伤加重,因此Prdx6的抗氧化作用减轻了细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤。关键词:肺损伤;细菌脂多糖;Pcroxi rcdoxi n6;氧化应激第二部分Peroxi redoxi n6减轻细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的抗炎、抗纤溶作用目的:基质金属蛋白酶(M M Ps)通过降解基底膜胶原,增加血管内皮通透性;纤溶酶原激活物抑制物( PAI) .1通过抑制纤溶酶原激活和纤维蛋白降解从而抑制纤溶,增加肺泡透明膜形成。本研究旨在探讨Prdx6在细菌脂多糖(LPS)所致小鼠急性肺损伤中有无抗炎、抗纤溶作用。方法:本实验应用雄性Prdx6基因敲除小鼠和同基因背景的C57BL/6J 野生型小鼠,以LPS 5m g/kg气管滴入制备急性肺损伤模型,分别于用药后4d, 时、24d, 时检测肺脏病理学表现,湿/干比、支气管肺泡灌洗液( BALF) 内蛋白浓度,核因子( N F).诏活性,肿瘤坏死因子(TN F)-a、白介素(IL)-l p、M M P.2、M M P.9和PAI.1的表达。结果:气管滴入LPS后小鼠发生急性肺损伤。LPS致伤后,与C57BL/6J 小鼠对比,Prdx6基因敲除小鼠N F.r, B活性明显增强且以用药后4小时为重;肺脏TN F.a、IL.1B、PAl .1 m RN A表达显著增高并呈时间依赖性趋势;BALF内TN F.a、 博士学位论文中文摘要IL.1p、PAI.1蛋白浓度显著增高,以用药后4小时为重,24小时下降近基线水平;血浆内PAI.1蛋白浓度显著增高并呈时间依赖性趋势,而C57BL/6J 小鼠仅在用药后24小时较对照组者显著增加;肺脏M M P9,M M P2m RN A表达显著增高并呈时间依赖性趋势,而C57BL/16J 小鼠仅在用药后24小时见M M P9m RN A表达较对照组者显著增加;脚.9活性明显增强且以用药后4小时为重。结论:Prdx6基因缺失使LPS对N F-zB激活增强,继而介导M M P.9,PAd.I表达增加从而使LPS诱发肺损伤加重。因此Prdx6有抗炎、抗蛋白酶、抗纤溶活性,减轻了细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤。关键词:细菌脂多糖;Peroxi redoxi n6:核因子-rB;基质金属蛋白酶;纤溶酶原激活物抑制物第三部分Peroxi redoxi n6通过RO S.M APKs通路影响细菌脂多糖所致巨噬细胞产生基质金属蛋白酶9目的:细菌脂多糖( LPS) 刺激巨噬细胞可活化核因子( N F) -r.B和促分裂原活化蛋白激酶(M AP融)介导炎症信号的转导。本研究旨在探讨Prdx6在细菌脂多糖( LPS) 所致小鼠巨噬细胞炎症中对M APKs通路的活化及影响基质金属蛋白酶(M 旧).9的信号通路。方法:本实验应用雄性Prdx6基因敲除小鼠和同基因背景的C57BL/6J 野生型小鼠,原代培养肺泡和腹腔巨噬细胞,LPS刺激4小时后测定巨噬细胞内活性氧簇(RO S)水平:应用ERKl /2抑制剂PD98059、J N K抑制剂SP600125、p-38M APK抑制剂M L3403和LPS刺激细胞4d, 时后测定肿瘤坏死因子( 耵吓) 吨、白介素( IL).1B和M M P.9的表达。结果:与C57B啪J小鼠对比,Prdx6基因敲除小鼠巨噬细胞内RO S含量显著增高,经LPS刺激后升高更为显著;LPS刺激后,与C57BL/6J 小鼠对比,Prdx6基因敲除小鼠巨噬细胞TN F-ff.、IL.1B和M M P9的m RN A和蛋白表达显著升高;应用ERKI/2抑制剂PD98059、J N K抑制剂SP600125显著降低M M P 9的m RN A和蛋白表达。结论:Prdx6基因缺失使LPS刺激所致巨噬细胞的炎症反应加重,诱导M M P.9表达增高主要是通过活化ERK和扑黼路。关键词:细菌脂多糖;Pcroxi redoxi n6:促分裂原活化蛋白激酶;基质金属蛋白酶 博士学位论文英文摘要ABSTRACTPartI:Rol es ofperoxi redoxi n 6 i n theregul ati on ofoxi dati ve stress tol i popol ysacchari de-i nducedacutel ungi nj uryobj ecti ve:Peroxi redoxi n(Prdx)6i s a novel non-sel enoperoxi dasethat catal yzethereducti on ofH e02,fattyaci dhydroperoxi desandphosphol i pi d hydroperoxi des.n圮present studyai m sati nvesti gati ngrol es of peroxi redoxi n6 i n theregul ati onofoxi dati ve stress tol i popol ysacchari de—i nducedacutel ung i nj ury(ALl )i nm i ce.M ethods:Fromm al ePrdx6(./.)m i ceand C57BL/6Jm i ce,pri m ary m acrophagesW ere cul turedforreacti veoxygen speci es( RO S) test.ALlw asi nduced byi ntm trachealadm i ni strati onof LPS( 5m g/kg) .Fourhoursaftersti m ul ati on,m orphol ogy, w et/dry rati o,protei nconcentrati on i n bronchi al al veol arl avagefl ui d( BALF) ,m yel operoxi dase( M PO ) acti vi ty,hydrogenperoxi de(I-1202),m al ondi al dehyde 0VIDA),protei n carbonyl afi on, totalsuperoxi de di sm utase( SO D)and total anti -oxi dati vecapabi l i ty frAO C) w eretested.Resul ts:The l evel of RO S i nm acrophagesfromPrdx6( 乒) m i cew assi gni fi cantl yhi gherthanthatfrom C57BL/6Jm i ce,w hi ch W aseven hi gheral terLPSadm i ni strati on.LPS—i nduced ALl w as characteri zedbyi nfl am m ati oni nm orphol ogy,i ncreasedw et/dryrati o and el evatedprotei nconcentrati on i nBALF.Com paredw i tl lvehi cl e treatedm i ce,thel evel s of M POacti vi ty,H 202and M D Aw eresi gni fi cantl yi ncreased, w hi l eSO Dand TAO C、ve他m arked decreasedi n LPS treated w i l dtypem i ce,w hi chw ere m ol esoi n Prdx6( -/-) m i ce accom pani ed诵th protei ncarbonyl ati on.Concl usi ons:Prdx6(-/-)m i ceaccum ul atedhi gheri ntracel l ul ar RoS l evel s,w hi chcause LPS-i nducedl ung i nj urym oreseverel y,and thus,suggestedthat Prdx6 acts asani m portant scavengerof RO S underoxi dati vestress.Keyw ords:acute l ung i nj ury(ALI);l i popol ysacchari de(LPS);Peroxi redoxi n6;oxi dati ve sta' essPart1T:Rol es ofperoxi redoxi n6i n theregul ati on ofi nfl am m ati on andfi bri nol yti e acti vi tytol i popoIysacchari de-i nducedacutel ung i nj uryobj ecti ve:M atri x m etal l opm tei nases( M M Ps) areabl e todegradethe extracel l ul arm atri xSO asto i ncrease vascul arperm eabi l i ty.Pl asm i nogenacti vatori nhi bi tor(PAI)-lcan i nhi bi t pl asm i nogen acti vati on,fi bri n degradati on resul ti ngi nhyal i nem em braneproducti on.The presemstudyai m s ati nvesti gati ngrol es ofperoxi redoxi n皇 博士学位论文英文摘要6 i n theregul ati onof i nfl am m ati on andfi bri nol yti c acti vi tyto LPS-i nduced ALI i nm i ce.M ethods:ALl w as i nducedbyi ntratracheal adm i ni strati on ofLPS(5m g/kg).Four0r24hrs after LPSadm i ni strati on, hi stol ogy,w et/dry w ei ght rati o,protei nconcentrati onal veol arl avage fl ui d( BALD,nucl ear factor呷)和activity, theexpressi onof tl Ⅱnor necrosi sfactor(Tl 虾)-a,i nterl euki n 0L) -l p,M l VIP· 9,M M P-2i n bronchi aland PAI.1 w ere m easured.Resul ts:After LPS adm i ni strati on, N F-r, Bw as acti vated.Theexpressi onsofTN F- Q ,IL-1Band PAI· 1 m RN A w eresi gni fi cantl yi ncreased i n ati m e-dependantm anner andthe concentrati onof’ D晒吨,IL-l pand PAI-1 i n BALF w eresi gni fi cantl yi ncreased at4hrs and decreasednearl yto basel i ne at 24hrs,w hi ch w el ' e m ore so i n Prdx6q七m i ce than those i n C57BL/6J m i ce.1f1圮concentrati on of PAI-1 i npl asm aw assi gni fi cantl yi ncreased i n ati m e dependantm ann廿"i n Prdx6U 0m i cecom paredtom i ce.n伧expressi onof M M P9 and M M P2 m RN A w erethati n C57BL/6Jsi gni fi cantl yi ncreased i n ati m e-dependantm anner i nPrdx6(-/-)m i cethan those i nC57BL/6J m i ce.M M P9 m RN A W asonl y si gni fi cantl yi ncreased at 24 hrs w hi l eM M P2 m RN Aw 雒notchangedi n C57BL/6J m i ce.Theacti vi tyof M M P一9 w as m ol ' esi gni fi cantl yi ncreased at 4hrs and 24hrs i n Prdx6U ● m i cethan that i n C57BL/6Jm ice.Concl usi ons:N F-r, B W as m ore acti vated i nPrdx6(-/-)m i ce,consequentl y m edi ati nghi gher expressi onof M M P9 and PAI-1,w hi ch陀sdtedi n LPS-i nducedl ung i nj urym oreseverel y, andthus,suggestedthatPrdx6possessesani m portantanti —i nfl am m atoryandanti · fi bri nol yti e acti vi tyunder i nfl am m ati on.Keyw ords:acute l ung injury阻I);lipopolysaecharide(LPS);Peroxiredoxin6;m atri xm etalloproteinase(脚);plasm inogenacti vam ri nhi bi tor(PAl )· lPartH I:Peroxi redoxi n6i ncreasesLPS-sti m ul ated M M I' 9andeytoki neexpressi oni nm aerophageby enhanci ngM APKspathw ayO bi eeti ve:M APKscan beacti vatedunder LPS sti m ul ati on to m edi atei nfl am m atorysi gnaltransducti on.Thepresent studyai m s ali nvesti gati ngrol es ofperoxi redoxi n6i n theregul ati onofm i togen-acti vated protei n ki nase(讹廿&)acti vati onand m atri xm etal l oprotei nase( M M P) -9secreti onunder LPS sti m ul ati on.M ethods:Pr岫m acrophagesfromm al ePrdx6(-,-)m i ceandC57BU 6J m i ce W gTgcul turedand sti m ul ated under LPStogether、Ⅳi tl lextracel l ul arsi gnal -regul atedki nase4 博士学位论文英文摘要0三RX)i nhi bi torPD 98059,c-J unN -term i nal ki nase(J N K)i nhi bi torSP600 1 25 orP-38ki nase i nhi bi tor M L3403.Theexpressi onof reacti veoxygen speci es(RO S),tum ornecrosi sfactor(TN -F).x,i nterl euki n(IL)-1 pandM M P- 9w ere m easured.Resul ts:LPS W as found to i nduce theproducti onof reacti veoxygen speci es(RO S)w hi ch W aS m oresi gni fi cantl yi nPrdx6(./.)m i ce.LPS-i nduced hi gherM M P一9 andcytoki nes expressi oni nPrdx6(./-)m i ce,w ere suppressed byERK and J N Ki nhi bi tors,but notby p38ki n雒e i nhi bi tor.Concl usi ons:RO S· · ERK/J N Kcascadem edi ati ngLPSsi gnal i ngtoM M P· · 9expressi onresul ted i n LPS-i nducedi nfl am m ati on m oreseverel yi nrnaerophagesfromPrdx6(-/-)m i ce.ERKand J N K w e坞essenti al for theexpressi onof M M P- 9 i n m i cem aerophagesi nresponsetoLPS w i th Prdx6defi ci ency.Keyw ords:l i popol ysacchari de(LPS);Peroxi redoxi n6;m i togen-acti vated protei nki nase(M APK);m atri x m etal l oprotei nase(M M P)S 博士学位论文英文索引英文缩写索引英文缩写英文全称acutel ungi ni u珂acuterespi ratorydi stresssyndrom ebi ci nchoni ni c aci dbonem arrow -deri vedm acrophagescom pl em entaryD N ADi chol orofl corescei n di acetatedi m ethylsul foxi deenzym el i nked i m m unosorbentassayel ectrophorefi c m obi l i tyshi Rassayextracel l ul arsi gnal -regul atedki nascALIARD SBCABM 删CD N AD CFD AD M S0ELISAEM SAERKH 202ILI词胍脚KM D AM M PsM P0m RN Ahydrogenperoxi dei nterl euki ni nhi bi tor r, Bprotei nc-J unN -term i nal ki nasem i togen-acti vated protei nki nasem al ondi al dehydem atri xm etal l oprotei nasesm yel operoxi dasem essengerri bonucl ei c aci dnucl earfactor-kappaBN F.zBO Dopfi cal densi typl asm i nogenacti vator i nhi bi torphosphatebuffered sal i nepol ym crasc chai n他acfi onreacti ve oxygenspeci esroundsperm i nutenU .1PBSPCRRO SrpmIm PCRSO DTAO CTN F吨t um or necrosi s factor-aw “ dry w ei ght rati ol qeVel "setranscri pti on.PCRsuperoxi dcdi sm utasetotal anti -oxi dati vecapabi l i ty、M 『D rati o6中文全称急性肺损伤急性呼吸窘迫综合征二喹啉甲酸骨髓趋化的巨噬细胞互补脱氧核糖核酸二氯荧光乙酰乙酸盐二甲基亚砜酶联免疫吸附试验凝胶电泳迁移试验胞外信号调节激酶过氧化氢白细胞介素核因子.心抑制蛋白氨基端激酶促分裂原活化蛋白激酶丙二醛基质金属蛋白酶髓过氧化物酶信使核糖核酸核因子-r, 。B光密度纤溶酶原激活物抑制物磷酸盐缓冲液多聚合酶链反应活性氧簇每分钟转数逆转录聚合酶链反应超氧化物歧化酶总抗氧化活力肿瘤坏死因子吨湿干重比 博士学位论文前言前言急性肺损伤/急性呼吸窘迫综合征( AcuteLung Inj ury,ALI/acute respi ratorydi stresssyndrom e,ARDS)是指在严重感染、休克、创伤及烧伤等非心源性疾病过程中,肺毛细血管内皮细胞和肺泡上皮细胞损伤,通透性增加,弥漫性肺间质及肺泡水肿,导致急性进行性缺氧性呼吸衰竭,主要表现为呼吸窘迫和弥漫性肺浸润的一组临床综合征( 1) 。其进展较快,且晚期多诱发或并发多脏器功能障碍综合征( M O DS) 、多脏器功能衰竭( M O F) 。至今,ALI/ARDS的发病机理仍不清楚。仅美国每年就有报道ARDS的发病达15万人次,虽然近年来开展了体外膜肺、活性蛋白C等新技术,目前仅保护性机械通气治疗可减低死亡率,但仍高达50%以上( 2) ,而我国的相关报道在ICU 收治的ARDS病死率更是高达70%( 3) 。居高不下的发病率和死亡率的根本原因是尚未完全了解ALI/ARDS的发病机制。ALI/ARDS的病理改变主要为肺水肿(包括肺泡和肺间质水肿)、炎性细胞浸润、透明膜形成和肺组织破坏。目前级联放大的瀑布样炎症在肺损伤的发病机制中已经得到公认,氧化应激、凝血纤溶失衡等在ALI/ARDS的发病中扮演了重要角色也达成了共识(4,5)。氧化应激是指体内活性氧簇(reacti ve oxygen speci es,RO S)的生成超过抗氧化系统防御能力的一种状态(6)。氧化应激会导致机体出现氧化损伤、炎性反应、细胞坏死、细胞凋亡,氧化应激也可激活免疫反应( 炎性因子释放导致中性粒细胞浸润、巨噬细胞激活) 加重应激损伤。RO S引起肺损伤的机理包括脂质、蛋白质、核酸的过氧化、刺激转录因子( 如核转录因子)活化(7,8)。脂多糖(LPS)诱导的ALl 模型表现为毛细血管通透性增加,肺泡和问质水肿,炎症细胞聚集( 9,10) ,能很好的模拟临床常见病如肺炎、脓毒血症所导致的肺损伤。LPS所致肺损伤有多种机$1J (11.13):LPS可募集活化中性粒细胞并激活核转录因子N F.r, B,刺激细胞因子的产生:气管内滴入LPS后3-6小时可引起小鼠肺脏肿瘤坏死因子( n师) .仅,单核细胞抑制蛋白( M IP) -2,白介素( IL).6表达增加;信号转导子及转录激活子( si gnaltransducerand acti vatoroftranscri pti onSATA) 4和6也可调控LPS所致的全身炎症反应,STAT4和STAT6缺失小鼠通过增加N F.rB的激活和IL.12等致炎细胞因子和趋化因子的产生导致对致死性内毒素血症更敏感;热休克蛋白70( hsp70) 通过调控诱导型一氧化氮合酶而保护小鼠肺损伤。LPS可通过活化N ADPH 氧化酶增加活性氧簇的产生,造成DN A和蛋白氧化并可活化转录因子N F.心。Peroxi redoxi ns( Prdx) 是新近10年才发现的广泛存在的非硒基依赖的过氧化物酶超家族,依据包含有l 或2个半胱氨酸残基而进一步分类为l -CysPrdx( Prdx 博士学位论文前言1-5) 或2-CyPrdx( Prdx6) 。Prdx6是由224个氨基酸组成,分子量为25.1kDa。Prdx6是双功能蛋白,有谷胱甘肽过氧化物酶和磷脂酶A2的活性。Prdx6的过氧化物酶活性首次是从牛眼的睫状体分离出的蛋白显示的(14),利用硫氧还蛋白作为电子供体,能还原H 202、短链氢过氧化物、脂肪酸氢过氧化物和磷脂氢过氧化物( 15,16) 。与其它器官相比,Prdx6在肺内富集并且尤其高表达在Cl ara细胞和肺泡Ⅱ型上皮细胞中(17)。已经有研究显示帕金森痴呆患者(18)、散发的Creutzfel dt-J acDb病(19)、Pi ck病脑内(20)、在恶性间皮细胞瘤(21)、高分化鳞癌的肺内(22)、皮肤创口的愈合边缘(23)等Prdx6蛋白或nduN A的表达升高。Prdx6具有抗氧化性在肺损伤模型中得到了证实:现发现在小鼠肺内通过腺病毒载体而致的Prdx6基因的过表达可减轻高氧所致的肺水肿并增加存活率(24);Prdx6基因敲除小鼠增加了对高氧或百草枯诱导的肺损伤的敏感性(25,26);Prdx6基因过表达的转基因小鼠对肺脏或肺泡Ⅱ型上皮细胞的氧化应激有明显的保护作用( 27) 。综上所述,既往的研究多关注于Prdx6在肺脏氧化损伤中的抗氧化作用,尚无Prdx6有无抗炎作用及相关机制的研究,其是否会在LPS所致肺损伤中发挥作用未见有报道。近来,有学者报道在LPS诱发实验性肺损伤中,Prdx超家族成员Prdx2和Prdx3的作用。Prdx3敲除鼠由于体内RO S清除障碍,加剧了LPS刺激后DN A和蛋白氧化,肺损伤更重( 28) 。Prdx2敲除鼠对LPS诱发的致死性休克更明显,且应用编码Prdx2的腺病毒治疗后损伤得到明显改善(29)。在LPS诱发肺损伤中,核因子N F.r, B被激活进而发挥了重要作用。现已有研究证实了N F.rB和Prdxs的负向调节关系:脱氧胆酸诱导的大鼠肝细胞死亡与N F.r, B的活化有关并继而抑制Prdxl 和Prdx2的转录活性( 30) ;在LPS刺激下,Prdx2缺失小鼠N F-rB活性增加更为显著(29);对小鼠肝脏细胞的研究显示,抑制N F.rd3明显增加了Prdx6的表达(31)。基于以上考虑,本研究假设Prdx6对小鼠LPS所致肺损伤具有保护作用,其机制可能在于Prdx6的抗氧化作用减少了RO S的产生,从而抑制了蛋白和脂质的氧化;探讨Prdx6有否RO S依赖性抗炎作用,抑制核转录因子N F-rB激活,从而抑制炎症基因的表达,最终减轻肺损伤。本研究拟气道给药建立LPS所致小鼠肺损伤模型,对比Prdx6基因敲除鼠和同基因背景下的野生型C57BL/6J 小鼠,观察Prdx6对LPS所致肺损伤的作用;以转录因子N F.rB为核心,结合炎症基因表达的改变,探讨Prdx6参与调节LPS诱发肺损伤的可能机制,进一步阐明肺损伤的发病机制寻求基因治疗的新靶点,也为临床开发治疗肺损伤的靶向药物提供新的思路。8 博士学位论文第一部分第一部分Peroxi redoxi n6减轻细菌脂多糖诱发小鼠急性肺损伤的抗氧化作用急性肺损伤( ALl ) /急性呼吸窘迫综合征( AIm S) 是由多种病因诱发的肺泡上皮和毛细血管膜结构损伤、氧合功能严重障碍,主要表现为呼吸窘迫和弥漫性肺浸润的临床综合征。至今,ALFARDS的发病机理仍不清楚。细菌脂多糖( LPS) 诱导的ALI模型表现为毛细血管通透性增加,肺泡和间质水肿,炎症细胞聚集(9,10),能很好的模拟临床常见病如肺炎、脓毒血症所导致的肺损伤。大量实验研究证明ALI发病机制中氧化应激起了重要作用:活性氧簇( RO S) 可通过脂质、蛋白过氧化,核酸损伤,刺激转录因子活化等引起肺损伤( 4) 。Peroxi redoxi ns( Prdx) 是新近l O 年才发现的广泛存在的非硒基依赖的过氧化物酶超家族(15) ,Prdx6是包含有2个半胱氨酸残基的亚型07) 。目前研究报道Prdx6可保护高氧和百草枯所致肺损伤(25,26),Prdx2、3可保护LPS所致的肺损伤(28,29)。Prdx6是否会在LPS所致肺损伤中发挥作用未见有报道。本研究假设Prdx6对LPS诱发的小鼠急性肺损伤具有保护作用。拟应用LPS气管滴注建立急性肺损伤模型,观察Prdx6对LPS诱发急性肺损伤的作用,并初步探讨其治疗机制。材料和方法l 实验材料1.1实验动物试验设计被复旦大学动物保护委员会同意。动物使用和处理遵照美国国立卫生署颁布的“ 实验动物保护和使用指南” 。选用雄性C57BL/6J 小鼠和Prdx6基因敲除小鼠( C57BL/6J 小鼠来自复旦大学实验动物中心,上海,中国:Prdx6基因敲除小鼠由Pennsyl vani a大学医学研究中心AronB.Fi sher教授实验室引进),体重22:1:29,8· 12周龄。1.2主要药物、试剂戊巴比妥钠Fl uka公司氯胺酮上海禾丰制药有限公司LPSSi gm a公司青链霉素Si gm a公司RO S高质荧光测定试剂盒G EN M EDSCIEN FIFICS公司D M EM ( D ul becco’S M odi fi edEagl e’ S M edi um ) H ycl one公司胎牛血清(Defi nedbovi ne cal fserum ) H ycl one公司9 博士学位论文第一部分胰蛋白酶(Trypsi n)O i h:o公司20xPBSSangon公司电泳级琼脂糖Fl uka公司D N A2000M arkerTakara公司M PO 、SO D、H 202、M DA、TAO C、蛋白羰基检测试剂盒南京建成生物工程研究所考马斯亮兰蛋白质定量试剂盒BCA蛋白质定量试剂盒Pi erce公司南京建成生物工程研究所组织基因组DN A提取试剂盒Q i agen公司引物合成Sangon公司R& D 公司DAB显色试剂盒H RP山羊抗兔IgG福建迈新公司Prdx6单克隆抗体Chem i con公司二甲苯上海生工公司甲醛上海国药集团化学试剂有限公司肝素上海生物化学制药厂乙醇上海国药集团化学试剂有限公司1.3主要实验仪器设备H eraeusC02恒温培养箱H er神憾公司倒置显微镜O l ym pus公司荧光显微镜O l ym pus公司苏州净化设备公司超净工作台FACSean流式细胞仪BeetonDi cki nson公司G eneAm pPCRSystem2400Perki nEl m er公司微量注射器显微外科器械上海安亭手术仪器厂上海手术仪器厂H angpi ngFAl104电子天平上海天平仪器厂动物固定架自制医用缝线上海强生公司22号一次性密闭式静脉留置针( 支气管灌洗插管用)BD 公司酶标仪( W el l seanM K2)芬兰Labsystem s紫外分光光度仪( RN A,蛋白浓度测定)Eppendorf公司电泳仪Bi o-Rad Pow cr/PAC 3000实时荧光定量PCR仪( 7900)ABI PRISM 博士学位论文第一部分细胞计数板上海医疗设备厂上海医疗设备厂普通照相显微镜日本O l ym pus公司M i l l i .QBi ocel 纯水仪M i l l i pore公司Bi o—Rad公司电泳仪(Bi o.RadPow er/PAC3000)恒温水浴箱Pol ySei enee公司洗液装置( W el l w ash4)混合器(Ⅻ.B)震荡器( KJ .201A)芬兰Labsystem s江苏省康健医疗器具公司江苏省康健医疗器具公司移液器Gi l son公司Centri fuge 5804R低温离心机Eppendorf公司Centri fuge58415D离心机水浴箱Pol ySci enee公司紫外可见分光光度计Eppendorf公司U ni cam H el i ox公司Axi oskop2Pl us生物显微镜ZEISS公司液氮罐( YDS.3型)成都金风液氮容器公司18号一次性密闭式静脉留置针( 灌洗肺循环用)BD 公司.80"C低温冰箱(HetoUl traFreeze) H et oU l t ra公司2实验方法2.1实验动物Prdx6基因敲除小鼠2.1.1 Prdx6基因敲除小鼠饲养和繁殖Prdx6基因敲除小鼠由Pennsyl vani a大学医学研究中心AronB.Fi sher教授实验室引进,l 雄1雌,共2只。将小鼠置于复旦大学实验动物中心洁净动物房内,室内温度18--, 22℃,湿度50%---60%,鼠笼、垫料、食物、饮水经高温高压灭菌处理。饲养过程中每天观察小鼠生长情况,入室人员穿无菌隔离衣、戴帽子、口罩、手套。垫料每周更换2—3次,饲料及饮用水每日补充。小鼠的性成熟期为60天左右,母鼠妊娠期为20天左右,繁殖采用1只雄鼠与1只雌鼠同居的方式进行。2.1.2小鼠的基因型鉴定对于引进小鼠依据合作方提供的序列,进行基因型鉴定。2.1.2.1小鼠尾部基因组DN A的提取步骤:1) 取每只小鼠尾巴0.8cm ( :S25m g) ,剪碎放入1.5m l EP管中;2) 加入DL液4001A,震荡悬浮,65℃温浴>15 m i n(期间间断颠倒EP管,使组织消化); 博士学位论文第一部分3) 加入DT液200I-a、RN aseA8山、Protei naseK251al ,迅速温和颠倒离心管数次,使混匀,65"(2温浴,15"-' 30 m i n( 期间间断颠倒EP管) ;4) 离心90009x3分钟;5) 将上清移至另一离心管,见清亮、黏稠提示消化完全;6) 加入异丙醇200td,剧烈颠倒使溶液混匀,全部移入吸附柱;7) 离心90009x30秒,弃液后,再离心90009x30秒;8) 将内柱移入一干净收集管,加入W 1液500山,静置l m i n:9) 离心90009x30秒,弃液;10) 再次加入W 1液500td:11)离心90009x15秒,弃液后,再离心90009x1分钟;12) 将内柱移入一新的1.5m l EP管,吸附膜中央加T1 100山,65℃温浴静置5分钟;13) 离心90009x1分钟即得组织基因组DN A,测O D值定量DN A浓度和纯度。所得DN A置.20℃保存待测。2.1.2.2基因组DN A的PCR反应1) 引物设计:由Pennsyl vani a大学医学研究中心AronB.Fi sher教授实验室提供,上海生工生物工程公司(Sangon)合成:Prdx6基因敲除鼠:产物大小:150bpForw ard:5’CTCAG G TG TAG G G G TCACTAG3’Reverse:5’( }ACTCTAG AO G ATCCCCG G3’同基因背景野生型小鼠:产物大小:437bpForw ard:5。AATGCTTACAATG旧TGAAACACCCACG 旧3’Reverse:5’CACCTCTTl ’rCCCCTLAG TCCAG G G AAG3’2) PCR反应O PCR反应体系小鼠尾基因组DN A4td10xPCRreacti on buffer( w i thoutM 92+)2.5mM gCl 2( 25m M )2Illpri m erforw ard1山pri m erreverse1pJdN rP( 10m M )O .5mTaqD N Apol ym erase( 5U /O ) 0.5山Steri l eH 2013.51xlTotal vol um e25山 博士学位论文第一部分匡)PCR反应参数:95℃预变性5分钟95℃变性30秒]60℃退火30秒冯。个循环72℃延伸1分钟.J72℃延伸10分钟2.1.2.3琼脂糖电泳进行基因型鉴定1)1.5%琼脂糖电泳凝胶:取电泳级琼脂糖粉1.59,加入IxTBE电泳缓冲液100m l 后,微波炉中加热煮沸使琼脂糖颗粒完全融化,室温下冷却至约40℃后,向瓶内加入10m g/m lEB5p.1混匀即可。2) PCR产物分析:取9i dPCR产物+10x电泳buffer l i d经1.5%琼脂糖凝胶电泳,应用BIO .RAD成像系统( GelD oe 2000 G el D ocum entati onSystem )分析结果。由Prdx6基因敲除鼠引物生成的产物为150bp条带,Prdx6基因敲除鼠出现条带而野生型不出现条带;由野生型鼠引物生成的产物为437bp条带,Prdx6基因敲除鼠不出现条带而野生型出现条带。2.1.2.4免疫组织化学染色检测小鼠肺组织中Prdx6的表达采用抗生物素蛋白.生物素.过氧化物酶(ABC)法,Prdx6单克隆抗体以1:1000稀释。1) 肺组织石蜡切片烤片:58℃30分钟。2)脱腊至水:二甲苯l 一÷ 二甲苯2-÷ 二甲苯3-÷ 100%乙醇--*95%乙醇一75%乙醇各2m i n,PBS洗c2次,各5分钟。3)抗原修复:切片放置0.01M 枸橼酸盐溶液中(预热至沸腾)微波10分钟,95℃(高火4分钟至沸腾,放片子,解冻4分钟,冷却1分钟,解冻4分钟),在枸橼酸溶液中冷却15分钟,PBS洗3次。4) 6%H 202封闭( 用PBS配置) :室温10分钟,PBS洗3次。5) 滴加5%BSA封闭液:室温20分钟,用枪头吸干BSA。6) 滴加一抗( 用BSA稀释) :室温l 小时( 或4℃过夜_室温平衡l 小时) ,PBS洗3次,每次2分钟。7) 滴加H I冲.抗小鼠/兔二抗( 福州迈新公司) :室温l 小时,PBS洗3次,每次2分钟。8) DAB显色:用DAB显色试剂盒。取l m l 蒸馏水,加A、B、C试剂各一滴,混均匀加至切片,室温显色,镜下控制时间( 3.5分钟) ,去离子水洗。9)苏木素复染2分钟一l %盐酸酒精洗一PBS洗3次,每次2分钟。10) 脱水:75%乙醇_95%乙醇-, 100%乙醇各两分钟_二甲苯3一二甲苯 博士学位论文第一部分2_二甲苯1。11) 封片:中性树胶封片、晾干阴性对照:用PBS液代替一抗,确定有无特异性结合。2.2小鼠肺泡、腹腔巨噬细胞原代培养RO S检测2.2.1小鼠肺泡、腹腔巨噬细胞原代培养1)选用Prdx6基因敲除鼠和同基因背景的C57BL/6J 小鼠作为野生型小鼠,8.12周龄,体重22士29。2) 颈椎脱臼法处死小鼠,75%乙醇浸泡。3)取小鼠颈部正中切口,分离出气管后,以22号套管针气管插管固定。4) 无菌注射器抽取l m l 预冷至413,含5%FBS的DM EM 培养基。灌洗双侧支气管肺泡,将培养液注射入胸腔后,轻柔按压小鼠胸部2分钟,回吸培养液。5)共灌洗3次,混匀支气管肺泡灌洗液置于冰上。6)无菌镊子提起小鼠腹部皮肤,剪-d, 口,从两边向小鼠背部方向剪开皮肤(勿剪破腹膜),用大镊子向上下方向撕开皮肤,充分暴露腹壁。75%乙醇冲洗暴露的腹壁。7) 无菌注射器抽取4rnl 预冷至4"C,含5%FBS的DM EM 培养基。从左下腹将培养液注射入腹腔,按揉小鼠腹部2分钟,充分灌洗腹腔。8)无菌眼科镊子提起腹膜,剪刀在腹膜正中剪一切口,无菌吸管吸取灌洗的腹腔液3.5tnl 左右。9)将肺泡灌洗液和腹腔灌洗液4℃离心1, 0009x10分钟,弃上清。10) 计数细胞,按照5x105接种6孔板,加入2m l 含10%FBS、100U /m l 青霉素和100U /m l 链霉素的DM EM 培养基,孵箱内培养2--3小时。11) 弃上清,PBS清洗3次,除去未贴壁细胞,加入2m l 含10%FBS、100U /m l青霉素和100U/越链霉素的D垭M 培养基。12) 应用LPS l删刺激细胞4小时,加用PBS为对照组。2.2.2小鼠肺泡、腹腔巨噬细胞RO S检测A.原理本实验采用透膜荧光染色剂氯甲基二氯二氢荧光素二乙酯( CM .H 2DCFDA) ,它可完全自由通过细胞膜,并在细胞内长期滞留而不易外漏。在细胞氧化条件下一旦被过氧化氢、羟自由基或氢氧基、过氧化基、次氯酸等氧化,便产生荧光,据此定量检测细胞内RO S的生成和增加。B.试剂盒组成1) G EN M ED 清理液( RegentA) :60毫升2) G EN M ED 染色液( RegentB) :100微升14 博士学位论文第一部分3) G EN M ED 稀释液( Regent C) :20毫升4) G EN M ED保存液( Regent D) :10毫升C.准备试剂实验开始前,将贮存于一20℃冰箱里G EN M ED染色液( Regent B) 置入冰槽中融化,G EN M ED稀释液( Regent C)放进37"C恒温水槽里预热。然后按照每份标本移出5微升G EN M ED染色液( Regent B) 到新的15毫升离心管,加入对应的495微升G EN M ED稀释液( Regent C) ,混匀后标记为G EN M ED染色工作液,置入暗室里。D.检测程序I间接法1)取出培养的巨噬细胞,小心抽去细胞培养液。2) 加入1毫升GEN M ED清理液( Regent A) 覆盖培养皿表面,而后小心抽去G EN M ED 清理液( RegentA) 。3) 加入1毫升含EDTA的胰酶,置入3712培养箱10.15分钟。4)吹打细胞后移入15毫升离心管,计数细胞后,移吐tl xl 06细胞到新的15毫升离心管,离,t二' 3009× 59钟。5) 小心抽去上清液,加入1毫升含有G EN M ED染色液( Regent B) 和G EN M ED 稀释液( Regent C) 的G EN M ED染色工作液,吹打混匀细胞。6) 置入37"C恒温水槽孵育20分钟,避免光照。7)离,L, 3009x 59钟。8) 小心抽去上清液,加入预冷的200微升GEN M ED保存液( RegentD ) ,吹打混匀细胞,置入冰槽内待检。Ⅱ直接法1)取出培养的巨噬细胞,小心抽去细胞培养液。2) 力nX500微升含有G EN M ED染色液( Regent B) 和G EN M ED稀释液( RegentC) 的G EN M ED染色工作液,覆盖细胞。3) 置入37℃恒温水槽孵育20分钟,避免光照。4) 小心抽去含有GEN M ED染色工作液的细胞培养液。5) 加入500微升37"C预热的G EN M ED保存液( Regent D) 待检。E.结果计算与判断I间接法使用流式细胞仪分析:波长488nm 氩离子激光,观察10,000个以上细胞,波峰右移表明活性氧簇( RO S) 含量增高。 博士学位论文第一部分Ⅱ直接法使用倒置荧光显微镜观察:激发波长490nm ,散发波长530nm ,绿色荧光增强表明活性氧簇(RoS)含量增高。2.3急性肺损伤动物模型的建立小鼠以氯胺酮100m g/kg+氯丙嗪2.5 m g/kg体重腹腔注射麻醉,5分钟后麻醉生效。麻醉后仰卧位固定小鼠,颈部正中切口分离气管后,将滴注板倾斜600,直视下应用微量注射器穿刺气管,使针尖位于隆突上方,滴注生理盐水或LPS5m g/kg及1cm H 20空气。旋转小鼠使药物分布均匀,继续保持该体位10分钟,防止液体返流。于给药后4小时,应用戊巴比妥钠50m g/kg腹腔注射麻醉,留取支气管肺泡灌洗液、肺脏等相应标本。2.4实验分组动物被随机分为3个实验组( 图1) ,Control 组、Vehi cl e组、LPS组;每组均有C57BL/6J 小鼠和Prdx6基因敲除小鼠两个亚组,6—9只/组。具体分组及干预情况如下:Control 组:阴性对照组。Vehi cl e组:建立ALI动物模型时经气管内滴注4m l /kg的生理盐水,具体方法见动物模型制备。LPS组:建立ALI动物模型时经气管内滴注5m g/kg的LPS,具体方法见动物模型制备。图l 实验分组示意图。2.5支气管肺泡灌洗每组6只小鼠于给药后4小时,应用戊巴比妥钠50m g/kg腹腔注射麻醉,眼球取血后,气管插管,冰浴的生理盐水0.5m l 灌洗双侧支气管肺泡,共3次,回收率>85%。混匀支气管肺泡灌洗液置冰上,4"C离,I二' 1, 200rpm xl 0分钟,收集上清测定 博士学位论文第一部分支气管肺泡灌洗液内蛋白浓度I试剂盒组成BCA试剂A100NBCA试剂B20 InlBSA标准蛋白10、ri al每小瓶含2,ooo}tfm lBSA0.5IIl l ,设定的浓度梯度为分别为2000、1500、750、500、250、125、25、0}圳仪器:酶标仪II步骤A、配置BCAZ作液( W R)1) 每个样本需配置l nfl 的BCAI作液;2) 以50份BCA试剂A加1份BCA试剂B( 50:l ,试剂A:试剂B) 的比例混合以配置BCA工作液( W R) 。B、实验测定步骤( 样品和W R比例=1:20VA01) 分别吸50 pl标准品到相应的1.5“ 的EP管中(浓度为0-2,000弘咖11);2) 分别吸取50 pl 待测样品至相应的1.5m l 的EP管中;3) 每孔加入1IIl l 的W R,震板30秒以彻底混合均匀;4)37℃水浴30分钟;5)冷却至室温;6) 测量562 nm 附近( 540-590m n皆可以使用) 的各孔吸收值;7) 以校正过的BSA标准蛋白570nm 测量值对其浓度( I.tfm l ) 做图绘制标准曲线。使用标准曲线定量待测样品蛋白浓度。2.6肺湿干重比每组4只小鼠于给药后45时,应用戊巴比妥钠SO m g/l 【g腹腔注射麻醉,眼球取血后,开胸取出全肺,准确称量湿重后置于56℃烤箱,72d, 时后至重量不再变化称量干重,计算湿干重比(W 仍)。2.7肺组织形态学每组4只小鼠于给药后45时,应用戊巴比妥钠50rng/l 【g腹腔注射麻醉,眼球取血后,开胸取出全肺,浸入10%中性甲醛中固定24d' 时,再将肺组织常规脱水,石蜡包埋,切片(厚度为5岬),HE染色,二甲苯透明,中性树胶封固封片。光镜下观察肺组织炎性细胞浸润、水肿和损伤情况,严重程度评分( 32) 如下:无损伤=1,损伤25%=2,损伤50%=3,损伤75%=4,弥漫性损伤=5( 每个样品有三个切片,由病理学家随机分析,平均值作为样品评分)。 博士学位论文第一部分2.8髓过氧化物酶检测组织M PO 活性用来反映中性粒白细胞在肺组织含量,具体步骤按试剂盒说明操作如下:A、原理:中性白细胞中存在有髓过氧化物酶,每个细胞所含的酶的量是一定的,约占细胞干重的5%,该酶具有使过氧化氢还原的能力,利用这一特点可以分析酶的活力,并定量测定中性白细胞数目。其原理如下:M PO +H202专复合物:复合物+AH2(供氢体)专H20+M PO +A产物通过供氢体邻连茴香胺供氢后生成黄色化合物,在460nm 处通过比色测定产物的生成量,从而推算出M PO 的活力和白细胞的数目。B、试剂组成与配制:( 50T)试剂一:缓冲贮备液35m l x l 瓶,按需要量配成缓冲应用液,413保存。缓冲应用液的配制:贮备液:双蒸水=1:9试剂二:粉剂2支,临用时每支加缓冲应用液30m l 溶解,可37℃加热溶解,4℃保存。试剂三:粉剂3支,溶剂6m 1× 3支,用时1支粉剂倒入1支溶剂中溶解,最好提前一天配制,充分溶解后4℃以下保存。试剂四:24m l 溶液× 1瓶,天冷时会凝固,用前放入37℃以上的水中摇晃使其溶解至透明后方可应用,室温保存。试剂五:粉剂2支,4' 12保存。试剂六:溶液0.5m l xl 支,4℃保存。显色剂的配制:临用时将试剂五粉剂1支加蛰J 100nd缓冲应用液中,充分摇匀,待粉剂完全溶解后再加入试剂六0.1rnl ,充分混匀,配好后的显色剂4℃避光保存。试剂七:溶液6m l xl 支,413保存。C、组织样本M PO 测定:1、样本前处理:试剂二配制时浓缩一倍,即每支试剂二粉剂加到30nl l 缓冲应用液中;先用生理盐水为匀浆介质把肺组织制成10%匀浆,不要离心,取出部分10%匀浆按1:l比例加入浓缩一倍的试剂二溶液,混匀后取混合液0.9m l 加3号试剂0.1m l ( 9:1)充分混匀后37℃水浴15rai n,取出后待测。 博士学位论文第一部分2、操作表:试剂空白对照管测定管蒸馏水( m 1)O .23样本( m I)O .20.2试剂四( m 1)O .20.2O .2显色剂( m I)33混匀,37℃水浴30m i n混匀,60℃水浴10m i n,取出后立即在460nm 处,l cm 光径,蒸馏水调零,测各管O D值。3、计算公式:a酶活力单位定义:每克组织湿片在37"( 2反应体系中H 202被分解1pm ol 为1MP。单位,克湿片=塑譬普≥等篆杀磊等· 注:11.3为斜率的倒数;· · 注:取样中所含组织湿片的量(克)个酶活力单位。b计算公式:2.9过氧化氢( H 202) 检测A原理:过氧化氢H 202可以与钼酸作用生成一种络合物在405ri m 处测定其生成量可计算出H202的量。B试剂组成与配制:1、试剂一:液体60m lXl 瓶,4"C保存;2、试剂二:液体60m lXl 瓶,4"C保存;3、5%H 202标准品5m lx1瓶,4℃保存;0.5%H 202标准品应用液的配制:临用时按5%H 202:蒸馏水=1:9比例稀释。C操作方法:1、组织样本的前处理:准确称取组织重量,按重量体积比l :9的比例加生理盐水制成10%匀浆,离心4℃,2500rpm × 10m i n,取上清待测。 博士学位论文第一部分2、操作步骤:空白管标准管测定管试剂一( nd) ( 37℃预温)1l1蒸馏水( 血)0.10.5%I-1202标准品液(ri d)0.1样本( Inl )O.1混匀,37℃准确反应1分钟l试剂二( “ )I1l1lll混匀,于405ri m 处,l ena光径,蒸馏水调零,测各管吸光度值。3、计算公式:组翟;篙量=蒹鬻OD器OD× (篙63黼retoo笼1)+待测样本中蛋白含量(g/L)(m 册o,,三)标准管一空白管(1,£)⋯⋯一 ⋯⋯’ ⋯~注:0.5%H 202摩尔浓度为163m m oFL2.10丙二醛( m al ondi al dehydeM D A) 检测A测试原理:过氧化脂质降解产物中的M DA可与硫代巴比妥酸(rBA)‘ 缩合,形成红色产物,在532nm 处有最大吸收峰。· 因底物为硫代巴比妥酸(Thi babi turi cAci dTBA)所以此法称TBA法。B试剂盒组成与配制:( 50T)试剂一:液体l O rrdxl 瓶,室温保存。( 天冷时会凝固,每次测试前适当水浴加温以加速溶解,直至透明方可应用) 。试剂二:液体6m l xl 瓶,用时力1170m l 双蒸水混匀。试剂三:粉剂x1支,用时将粉剂加入到90"C.100"C的热双蒸水30m l 中,( 在溶解过程中可适当加热),充分溶解后用双蒸水补足至30m l 再加冰醋酸30rrd,混匀,配好的试剂避光冷藏。标准品:1011m ol /m l 四乙氧基丙烷5m l xl 瓶。C规范操作方法:l 、样本前处理:组织称重按重量/体积比加9倍的生理盐水制成10%匀浆,2500rpm /m i n,4℃离, 心l O m i n取上清待测。 博士学位论文第一部分2、操作表:标准管标准空白管测定管测定空白管¨10nm ol /m l 标准品(ha)0.1无水乙醇(IIl l )0.1测试样品( m 1)O .1O .1试剂一( m 1)0.1O .1O .1O .1混匀( 摇动几下试管架)试剂二( “ )1.51.51.51.5试剂三( m 1)O .5O .50.550%冰醋酸(IIl l )O .5旋涡混匀器混匀,沸水浴40m i n,流水冷却,然后3500rpra/m i n,412离, 1), 10rai n。取上清,532nm 处,l cm 光径,蒸馏水调零,测各管吸光度值。¨ 测定空白管可以不测,用标准空白管来代替测定空白管。3、计算公式:组织中M DA含量测定管吸光度一测定空白管吸光度标准品浓度蛋白含量( nm ol Im gprot) *标准管吸光度一标准空白管吸光度( 10nm ol /m 1) ( m gFrot/m 1)● nm ol /m gprot为纳摩尔/nag蛋白2.1l 蛋白羰基含量检测A测试原理:通过比色法测定蛋白质氧化的程度。B试剂盒组成与配制:( 50T)试剂一:匀浆介质,无色透明液体,50m l xI瓶;4℃保存;试剂二:浅砖红色液体,2.5m 1× 1瓶;4"C避光保存;试剂三:黄色液体,100m l × l 瓶;4"C避光保存;试剂四:无色液体,10m l × l 瓶;4℃保存;试剂五:无色液体,30m l xl 瓶;4℃保存;试剂六:无色液体,70m l × l 瓶;4℃保存;自备试剂:无水乙醇( 分析纯) ;乙酸乙酯(分析纯);无水乙醇乙酸乙酯混合应用液的配制:无水乙醇和乙酸乙酯按照体积比l :l的比例配置成混合溶液,现用现配:C规范操作方法: 博士学位论文第一部分l 、样本前处理:取组织块0.1克,在冰冷的生理盐水中漂洗干净,滤纸拭干,按照重量体积比1:9的比例加入试剂-(o.1克的组织中加入0.9m l 的试剂一),在冰浴条件下机械匀浆,将匀浆液用离心机3000rpndm i n离,Lqom i n,取上清即10%匀浆进行测定;取10%匀浆450I.tl ,加入509l 试剂二,室温放置10m i n后,11000rpndm i n离心10m i n,取上清进行蛋白质羰基的测定:同时取部分上清用考马斯亮蓝试剂盒( 货号A045-2) 测定匀浆的蛋白含量;2、操作表:一::i赢卜测定管对照管加入试剂(毫升)~\上清液O .10.1试剂三0.4试剂四0.4漩涡混匀1分钟,37℃准确避光反应30分钟试剂五0.5O .5漩涡混匀1分钟,在4。C下以12000rprn/m i n离心10m i n,弃上清液留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.01.O漩涡混匀1分钟,在412下以12000rpm /m i n离心10m i n,弃上清液留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.01.O漩涡混匀1分钟,在4"C下以12000rpm /m i n离心10m i n,弃上清液留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.01.0漩涡混匀1分钟,在4"C下以12000rpm /m i n离心10m i n,弃上清液留沉淀无水乙醇乙酸乙酯混合应用液1.01.0漩涡混匀1分钟,在4‘ C下,以12000rpm /m i n离心10m i n,弃上清液,留沉淀试剂六1.251.25混匀后,37"C准确水浴15分钟漩涡混匀,将全部沉淀溶解,处(紫外),0.5cm 光径石英比色皿,试剂六调零,测定O D。12000rpm /m i n离,t), Bm i n,取上清液在370ri m3、计算公式:蛋白质羰基含量一( nm ol /m gprot)测定管O D一对照管O D22x比色光径(cm )× 样本蛋白浓度(rag/L)● nm ol /m gprot为纳摩尔/m g蛋白× 125× 105 博士学位论文第一部分2.12总超氧化物歧化酶( Superoxi deDi sm utaseT-SO D) 活力检测A、测定原理:通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生超氧阴离子自由基(02一),后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色,用可见光分光光度计测其吸光度。B、测试盒组成与配制:( 5033l 、试剂一:贮备液:5m l xl 瓶(天冷时或放冰箱会有部分结晶析出,需热水浴溶解后再用);试剂一应用液的配制:用时加蒸馏水稀释至50m l ,4"0保存。2、试剂二:液体5m l xl 瓶,4"C---10℃保存。、3、试剂三:液体5m l xl 瓶,4℃.-.100c保存。4、试剂四:液体350ttl × 1支,4℃保存,不可冷冻:4号稀释液5m l xl 瓶,4℃保存。用时二者按1:14稀释,可以一次稀释,也可以分次稀释。配好的试剂四4"C保存,不可冷冻。配好后可保存2~3个月。注:所用吸嘴最好为专用且消毒处理过。5、试剂五:粉剂× 1支,用时加70℃一8...

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