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Survivin基因表达及其与胃癌预后关系的初步头探讨

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内容提示: 复旦大学硕士学位论文Survivin基因表达及其与胃癌预后关系的初步探讨姓名:汪全红申请学位级别:硕士专业:内科学指导教师:王吉耀20040414 背景Survi vi n基因表达及其与胃癌预后关系的初步探讨中文摘要Survi vi n基因为近年来新发现的一个抗凋亡基因,编码一种新的人体细胞凋亡抑制蛋白( hum ani nhi bi torofapoptosi s,hIAP) ,是抑制细胞凋亡的重要成分,其抑制作用远远超过bcl 一2,是迄今为止所发现的最小的hIAP蛋白,在正常成人组织中一般不表达,而在大多数恶性肿瘤中过度表达。基于其独特的结构、特殊的组织分布及明显的抗凋亡作用,survi vi n基因在恶性肿瘤早期...

文档格式:PDF| 浏览次数:7| 上传日期:2015-06-17 22:32:13| 文档星级:
复旦大学硕士学位论文Survivin基因表达及其与胃癌预后关系的初步探讨姓名:汪全红申请学位级别:硕士专业:内科学指导教师:王吉耀20040414 背景Survi vi n基因表达及其与胃癌预后关系的初步探讨中文摘要Survi vi n基因为近年来新发现的一个抗凋亡基因,编码一种新的人体细胞凋亡抑制蛋白( hum ani nhi bi torofapoptosi s,hIAP) ,是抑制细胞凋亡的重要成分,其抑制作用远远超过bcl 一2,是迄今为止所发现的最小的hIAP蛋白,在正常成人组织中一般不表达,而在大多数恶性肿瘤中过度表达。基于其独特的结构、特殊的组织分布及明显的抗凋亡作用,survi vi n基因在恶性肿瘤早期诊断、预后判断及靶向治疗中的应用价值而引起关注。目的本研究采用免疫组织化学法检测胃癌组织中survi vi n基因表达情况,随访胃癌根治术后患者的生存状况,分析其表达与胃癌病理分化程度、浸润深度、淋巴结转移及术后五年生存率之间的关系,探讨survi vi n基因表达与预后的关系,从分子水平估计胃癌预后。方法病例来源于1995.7.1996.6中山医院住院手术病人,采用免疫组织化学Envi si on二步法检测手术切除的胃癌病灶组织中survi vi n基因表达及其p53基因表达。肿瘤的病理类型根据H E染色结果,并结合临床检查、手术所见和病理检查确定肿瘤TN M 分期。所有病例随访至少5年或者直到死亡。比较不同病理类型、不同TN M 分期Survi vi n表达差异及其与p53基因表达的相关性。按Survi vi n基因是否表达比较两组生存曲线的差异。计数资料包括Survi vi n表达采用率或构成比描述,比较胃癌不同临床分期、浸润深度及有无淋巴结转移组中survi vi n基因表达率差异采用x 2检验,生存分析采用寿命表法,两组比较采用Logrank检验。 结果共有96例患者进入研究和随访观察。其中男性59例,女性37例;年龄最小29岁,最大84岁,平均56岁;肿瘤发生于胃底22例、胃体35例、胃窦35例,累及2个或以上部位4例;病理类型中腺癌78例,非腺癌18例,包括粘液腺癌8例,印戒细胞癌4例,未分化痛3例,另有鳞癌2例,类癌1例:癌灶局限于粘膜及粘膜下层13例,累及肌层18例,累及全层63例,不能判定浸润深度2例;伴淋巴结转移48例。96例胃癌组织中68例表达survi vi n基因产物,阳性率70.8%。胃癌的不同病理类型Survi vi n基因表达相似( 腺癌69.74%VS.非腺癌60.00%,p=O .369) ,腺癌中局限于粘膜及粘膜下层组Survi vi n基因表达低于固有肌层浸润及浆膜层浸润组(33.33%VS.81.25%& 75.93%,p=O .020)。伴有淋巴结转移的病例阳性率与无淋巴结转移的病例无差异( 68.09%VS.70.83%,p=O .771)。腺癌中高~中分化组低于低分化组(62.50%VS.82.05%,p=O .053),而Logi sti c回归分析表明survi vi n基因表达仅与胃腺癌浸润深度有关( p<O .05) 。Survi vi n基因表达与p53表达无相关性。68例survi vi n阳性表达的病例五年生存率为42.93%,低于28例survi vi n阴性组五年生存率( 52.93%) ,p=O .419;生存分析显示阳性组与阴性组生存曲线在病程早期无差异,后期渐显差异。结论survi vi n基因在胃癌中过度表达;其表达与胃腺癌浸润深度及分化程度相关阳性组与阴性组生存曲线在病程早期无明显差异,后期渐显差异。关键词:胃癌survi vi n基因预后免疫组织化学 Survi vi nExpressi oni n G astri c Cancerous Ti ssue and ItsRel ati onshi pw i thPrognosi sAbstractBackgroundSurvi vi n,thesm al l est hum an i nhi bi tor ofapoptosi s protei n(M AP)’ i sone novelm em ber of anti -cancerousgene fam i l y(foundi n1997).Survi vi ni s notexpressedi nnorm al adul t ti ssues but i nm al i gnant tum or.Survi vi n,w hi chi s si m i l ar w i thp53,hasi nduced thestudyi nterestsonearl y di agnosi sofm al i gnant tum or, prognosi sj udgem entandtarget therapy.0bj ecti vesO urstudyi s toexpl oretherel ati onshi pbetw een survi vi nexpressi onandgastri ccancerprognosi s.Im m unohi stochem i ealm ethodw as used to detect theexepressi onofsurvi vi ngenei ngastri ccarci nom a ti ssues resected fromgastri ccarci nom apati entsw i th curati ve tum or resecti on.Based on these resul ts.w eanal ysedtherel ati onshi pbetw een theexepressi onof survi vi n andpathol ogi cal grade,cl i ni cal stageand5一yearSBIVi val rate.M ethodsAl lthesam pl esw ere col l ected frompati ents w ho w eredi agnosedasgastri ccancer and underw entsurgeryi nShanghal ZhongShanH ospi talfromJ ul y1995 toIm m une—hi sto-chem i calanal ysi sm ethod“ Envi si on tw osteps” w asusedto detect survi vi n andp53 expressi oni n the resectedgastri ccancerous ti ssue.Cl i ni calstageW aS determ i nedby pathol ogi cal di agnosi sand di ni cal status.Al l the cases w erefol l ow edupat l east 5yearsor censoredbydeath.Survi vi nexpressi ondi fferenti ati onw erecom paredi n di fferentpathol ogi ca[ types,di fferentTN Mstagesand al so theJ une 1996.rel ati vi tyw i thp53w as studi ed.Survi valcurve w ascom paredi n the tw ogroupsw hether survi vi n w asexpressed.Resul tsTotal l y96caSeS(m al e:fem al e:59/37;age29—84years ol d,m eanage:56 yearsol d) w ererecrui ted.The l ocati on denoted aS:22 caSes i nfundus,35 cases i nbody,3 35 cases i n si nus,4cases w i th m ore than tW Ol ocati ons.Pathol ogi cal l y, 78casesw ere adenocarci nom a,18 w ere non—adenocarci nom a i ncl udi ng 8 cases of m ucusadenocarci nom a,4cases ofri ngcel l ul ar carci nom a,3cases of undi fferenti atedcarci nom a,2 casesof、squam ous carci nom a,1 case of carci noi dcarci nom a;13 casesw ere l i m i ted to m ucosa andsubm ucoca,18 cases l i m i ted to m uscul ari sl ayeL63 casesi nfl i trated to al l thel ayers.2cases cannot be determ i ned;48 cases w i ml ym phoi dm etastasi s.Total survi vi nexpressi onrate W as 70.8%r68/96).Si m i l ar expressi onratesexi sted i n di fferent pathol ogi cal types( adenocarci nom a VS.N on- adenocarci nom a,69.74%VS.60.00%,p20.369),Survi vi n expressi onrate w ashi gheri n the ti ssue w i thdeep l ayersi nfi l trated than thatsuperfi ci al l y i nfi l trated(1i m i ted to m ucosa andsubm ucosa vs.1i m i ted to m uscul ari sl ayer& i ni l i tratedto al l thel ayers.33.33%VS.81.25%& 75.93%,p=O .020、.Expressi onrate w as nothi gheri n cases w i thl ym phoi dsm etastasi s thannon—l ym phoi ds m etastasi s(68.09%VS.70.83%,p=O .771).Survi vi nexpressi onw as not rel ated top53 expressi on.5- yearsurvi valexpressedcases w as 42.93%,w hi chw as l ow er than that of 28 cases w i thout survi vi nrate i n 68 survi vi nexpressed(52.93%,p=O .419).Insurvi val curve,thereW as not asi gni fi cant di fferencei n theearl y stage( 2years) but aseperati onafter tw oyearsbetw eensurvi vi n.posi ti vegroupandsurvi vi n· negati ve group.oonCl U Sl onSSurvi vi n w ashi ghl y expressedi ngastri ccancer and rel ated w i th Tstageandpathol ogi cal grade,but not w i th Nstage,pathol ogi cal typeandp53 expressi on.Insurvi val cl l rve,there w as not asi gni fi cant di fference i n theearl y stage(2years)butaseperati on after tw o years betw eensurvi vi n-posi ti ve groupandsurvi vi n—negati vegroup.KeyW ords:G astri c carci nom aSurvi vi nIm m unohi stochem i stryPrognosi s4 引言胃痛发病率及死亡率在恶性肿痛中分居一、二位⋯,严重威胁着人类的健康。从大体形态及病理细胞学水平可大致判断预后情况。随着分子生物技术的发展,人们逐步发现中鼬形态学水平有时不足以准确地预测预后,而分子水平的研究可与形态学相互补充,提供一个更为完善的评价体系12J ,从而更加精确地判断预后,为临床选择合理的干预措施提供理论依据。目前研究认为,胃癌是多因素综合作用的结果,其发病与遗传因素、饮食习惯、亚硝胺类化学致癌物摄入及幽门螺旋杆菌( H el i cobacterPyl ori ,H p) 感染有关,包括多种癌基因激活和抑癌基因的失活。一般认为,胃癌的发生遵循“ 慢性浅表性胃炎一慢性萎缩性胃炎一肠上皮化生一不典型增生一胃癌” 这一进展模式【3],并与多种基因突变有关:( 1) 突变型p53及bcl 一2,分别作用于细胞凋亡的不同环节,抑制细胞凋亡,与肿瘤的发生、发展及侵袭相关;( 2) Ras基因突变,可影响其产物P21水解G TP( 三磷酸鸟苷) 的能力,最终可导致癌变;( 3) ri m 23基因,是一种新发现的被认为是肿瘤转移抑制基因,在恶性肿瘤组织中出现等位基冈的缺失,导致肿瘤的转移;( 4) GF( 生长因子) 家族,促进细胞增值、分裂、分化,与肿瘤的发生及侵袭有关。胃癌中EG F( 表皮生长因子) 、VEG F( 血管内皮生长因子) 及TG F( 转化生长因子) 均过度表达;( 5) E—cadheri n( 钙粘素) 为一种粘附因子,其结构及功能均依赖钙离子,能够抑制细胞生长,其在肿瘤中表达下调与肿瘤的侵袭成正相关。Survi vi n基因为1997年新发现的一个抗凋亡基因,Am bosi ni G14】首次报道该基因定位于17q25染色体,基因全长43|bp,编码~种新的人体细胞凋亡抑制蛋白( hum an i nhi bi tor ofapoptosi s protei n,hl AP) ,是抑制细胞凋亡的重要成分,抑制作用远远超过bcl 一2,是迄今为止所发现的最小的hl AP蛋白,由142个氨基酸组成,含有一个N 末端的杆状病毒凋亡抑制蛋白重复区( BIR) 序列,但没有环指状结构。生理状态下,除成人除子宫内膜组织、胎盘和胸腺组织中发现存在不同程度的survi vi n基因表达外,大多数组织均测不到survi vi n基因表达,这种分布模式与其他hl AP蛋白不同。其他hIAP蛋白如p53在生理状态下,。泛分布在成人各种组织中,不同组织仅仅表现为表达水平的差别。有人认为,survi vi n基因在胚胎组织中表达有利于组织器官的『F常发育‘ 讣。survi vi n基因在恶性肿瘤中存在的高表达:研究显示,绝大多数癌组织中存在survi vi n基因表达,不同癌组织表达阳性率不同,如胰腺癌阳性率76.9%--88.0%[ 63,乳腺癌阳性率60.O ~70.7%m ],胃癌阳性率30.O ~89.O %‘ 19-121,宫颈癌 69.5%13J ,朋癌阳性率70.0%[13l ,结肠癌阳性率63.5%114】。Am bosi niG[41发现sur' dvi n基冈在肺癌、肠癌、胰腺癌、前列腺癌及乳腺癌中广泛表达,定位于细胞浆,而在肿瘤周围『F常组织L}_】一般无表达;其在高分化淋巴瘤巾阳性率为55.0%,但在低分化淋巴瘤中缺乏表达。通过免疫组织化学染色技术发现14J ,在正常细胞中,survi vi n基因只在细胞惜J 期G2/M 期的细胞核中有表达;而在肿瘤细胞中,survi vi n基因主要存在于细胞浆中,而且survi vi n基因的作用位点capase( 半胱氨酸酶) 也存在于细胞浆,目前多认为survi vi n基因在细胞浆中发挥抑制细胞凋I=的作用。至于其确切的作用机制尚不十分明确。基于survi vi n基因独特的结构、特殊的组织分布及明显的抗凋亡作用,其在恶性肿瘤早期诊断、预后判断及靶向治疗中的应用价值而引起关注。国内外研究均显示其与恶性肿瘤发生相关[15-17]。至于是否与预后有关,报道不_』18。20】。关于其在胃癌中表达与胃癌患者生存状况之间的关系,圈内相关报道不多。本研究采用免疫组织化学法检测胃癌组织中survi vi n基因表达情况,随访胃癌根治术后患者的生存状况,分析其表达与胃癌病理分化程度、浸润深度、淋巴结转移及术后五年生存率之间的关系,探讨survi vi n基因表达与预后的关系,从分子水平估计胃癌预后,同时检测和分析P53基因表达及其与临床病理联系,从分子水平估计胃癌预后。6 材料和方法一.病例选择与临床随访病例来源于中山医院1995.7~1996.6住院接受胃癌于术患者总计203例,入选本研究标准:( 1) 胃癌根治术( 姑息性切除及探务术除外) :( 2) 术前均未接受放、化疗。最后96例患者符合入选条件进入本研究,他们均有详细的手术记录及病理资料,包括籍贯、年龄、性别、职业、手术方式、有无远处转移、病理分型、组织分化、浸润深度及有无淋巴结转移。survi vi n及p53基因表达采用免疫组织化学方法评价,所有病人均有术后组织留存的蜡块,每例患者重新连续切片四张,一张用于H E染色证实肿瘤诊断、组织分型及分化程度,二张用于免疫组化survi vi n基因表达及p53基因表达的检测,一张备用。病例随访所有病例随访至少5年或者直到死亡,从术后第一天计算,随访方式包括电话、去信、再次住院病历调阅及去上海疾病控制中心查阅肿瘤传报和死亡统计资料,包括术后治疗及胃镜复查等情况,如在随访期内死亡,则需证实其确切死亡原因,若死于非胃癌及其并发症,则归属失访。二.主要试剂1.一抗survi vi n鼠抗人单克隆抗体一l ( 8E2, N EO M ARKERS公司)2.一抗p53鼠抗人单克隆抗体( M 7001,DAKO 公司) ;3.二抗为通用型H RP( K4001, 13AKO 公司) 工作液( 即用型) 。三.主要仪器1.Lei tzl 512型切片机2.国产飞跃牌微波炉3.国产隔水式电热恒温培养箱4.O l ym pusBX4l 型光学显微镜5.O l ym pus BX50型数码相机四.方法和步骤实验采用免疫组化Envi si on二步法检测survi vi n基因及p53基因的表达,该方法为DAKO 公司新近推出的一种新的实验方法,即采用H RP( 辣根过氧化酶1标记一种特殊的多聚物与兔或鼠的免疫球蛋白连接成二抗,过程中只需一抗孵育和多聚物连接二步,该多聚物提供了增强的信号扩大单位,可提高一抗稀释度,该物质无生物活性,不和组织中生物素交叉反应,可选择多种显色剂显色。具有操作简便、着色敏感准确及结果可靠等优点,目前困内外临床及实验室中普遍采用该法。具体染色步骤包括: 1.石蜡切片烘” 30一60分钟( 60℃) ;2,二甲苯薤莞鳞二次,各l 转分镑;3.切片经100%酒精至70%洒精逐级梯度水化;4,蒸馏承冲洗;5.O .3%H 202甲醇液( 灭活内源性过氯化物酶) 室温_卜30分钟;6.抗原修复:切片浴于桐缘酸盐缓冲液中,置于微波炉,90· 98。C加热15分镑;抗蹶修复波配置如下:O .1M 枸橼酸溶液,取10.519枸橼酸( C6H 807.H 20)溶于500m l 蒸馁拳中;( 2) 储存液B:0.1M 枸橼酸钠溶液,( 1) 储存液A:取14.719枸橼酸钠fC6H 5N a307.H 20) 溶予500m l 蒸馏水中;( 3) 抗原修复液:A液9l al l +B液41m l +蒸馏水450m l ,以pH 试纸测定酸碱度为6.0+0.17+抗蹑修复蜃切片鬟于室淤下冷龆,蒸镶墩冲洗;8.TBS( 柠檬酸盐缓冲液1冲洗;柠檬酸盐缓冲液配置如下:( 1) Tfi s—H Ct缓、辟滚:Tfi s( -i 羟荦基氨基警烷) 619+H Ct37m 1+蒸镭承至1000m l ;( 2) 5%N aCI液:N aCl( 3) O .05M TBS缓冲液( pH 7,6) :Tri s.H Cl 缓冲液100m l +8+5%N aCI100m l +蒸馏水至1000m l859+蒸馏永至1000m l ;9.演搬第一撼体工俘渡( 联实验中显示survi vi n及p53最臻着色浓度鹭为1:50,TBS缓冲液稀释)50.100ul ,置4。C冰箱过夜;10。TBS洗3次,各5分铮;11.滴加通用型二抗H RP工作液( 即用型) 50.100ul ,鼹湿愈内室温下30一60分钟;12.TBS洗3次,各5分钟:13.滴加DBA(3,3一二氨基联苯胺四盐酸捕)显色液50ul ,5分钟:14,垂来承充分浚净;15.苏木索染色,5分钟;16.清承洗净;17.盐酸酒精分化,去除多余色;i 8.清承中返蓝:19.酒糖逐级脱承; 20+.甲苯透明,挝胶封片。五.对照将预实验中高表达survi vi n基因的已知阳性臀癌切玛‘ 散为阳性对照,TBS缓冲波代替~抗做为蹦性对照。六.结果观察翻织谫片染色后赢倍镜F观察f采孺盲法读片,郎谈片时不知道该患者的临床情况) ,取5个视野,总计数500个细胞,survi vi n显示肿瘤细胞浆着色涡阳性,p53显示细胞核淡黄至棕黄为阳性细胞,其中着色强度积分玲j :0=无着色,l =缨磨浆或细躯核见教在羞色颗粒,2=细腿浆或缨腿核见少量羞色黻粒,3一见大懿着色颗粒;着色细胞比例积分:0一着色比例小于5%、l =5-24%、2=25~49%、3—50~74%、4=75%残浚上;标记分数=蓿色强度× 蛰色跑镛,标记分数小于1属0级,l ~3属l 级,4~6属2级,7~9属3级,10~12属4级。表2凫疫组化结果判定标准9 七.H E染色每例常规行H E染色复诊,由病理科资深医乍读片证实切片中癌细胞能满足免疫组化实验的需要。八.统计分析将所有资料均输入计算机,应用spssl 1.5统计软件进行数据处理。计数资料包括Survi vi n表达采用率或构成比描述,比较胃癌不同临床分期、浸润深度及有无淋巴结转移组中survi vi n基因表达率差异采用x 2检验,生存分析采用寿命表法,两组比较采用Log rank榆验。 结果一。痰例的一般资料96例中男59例,女37例:年龄最小29.1岁,最大83.5岁,平均中位年龄56.4岁:发生于髯底、体、窦分剐为22、35、35{劳j ,多都位4铡;骧瘗砖恻,粘液腺癌8例,印戒细胞癌4例,鳞癌2例,类癌1例,宋分化癌3例;伴淋暇结转移49铡,萁余47嘲筠发现耱太淋巴结懋术焉瘸理未黢现癌缁施;瘸灶局黻于粘膜及粘膜下层13例,累及肌层18例,累及全层63例,不能判定浸润深度2例:病理分化按Bl oom —Ri chardson方法分高、中、低三型,分别为2、43、51例。表2l 晒床资料顼鞴铡数酉分比性别勇女年龄<60岁>;的岁发生部位霹底胃体霹襄多部位组织分型腺癌非腺癌分化稔度高~中低浸润深度+鞑膜及粘骥下爱I创有肌层浆膜震淋巴结转移无47——笪一一一~————。!!——+2铡不畿翔定浸满深度5937455l1318636l 。46%38.54%45.83%54.17%22.争2%36.46%36,46%4.16%81.25%18.75%46.88%53.12%13.83%19,15%6699%48.96%!!:!!墅舭霓筑邵醛0张堪 二。H E染色病理褥证实96例患者的旗蜡切烤均进行H E激色( 潮1) ’ 对每例患者的肿瘤诊断均进行髯证实,并对肿瘤类擞及分化程度等指标均进行了再确认。圈1眦染色( 腺癌,400X)三.胃癌组织中sl fi "vi vi n基因的表达按耘毽分数谬傍鲻铡孛68馕整survi vi n蓉爨褒运,粥牲攀为70.S%,粥性程度0、1、2、3及4分别占总数的29.2%、38.5%、13.5%、9.4%及9.4%,具俸情况觅袭3及圈2。survi vi n基因表透辩谯染色囊要定授于肿瘸细胞浆中,为粗细不均的淡黄或棕黄色颗粒,细胞核未见糟色,见( 图3~s) ,癌旁正常组织未觅表达。 表3survi vi n基因在胃癌中的表达图2m rvi vi n基因在胃癌组织中阳性表达分布13 图3洲vi vi n阴性(腺癌,200X)圈4survi vi n阳性( 艨癌,胞浆滋色,200X) 图5survi vi n阳饿(腺癌,胞浆着色,400X)图6survi vi n阳性<腺癌,胞浆着色,400X) 瑶7survi vi n鬻瞧(秧滚骧癌,鹣浆着色,400× )图8sarvi vi n隋性(印戒细胞斑,腿浆着色400× ) 四.Survi vi n基因表达与胃癌临床病理相关因素分析应用Pearsonx 2检验及Fi sher检验分析survi vi n基因与胃癌发生部位、组织分型、浸润深度、病理分化程度及有无淋巴结转移问的关系,按survi vi n基因表达分表达、不表达二组,其中不表达为0级,表达包括1、2、3及4级;发生部位分为胃底贲门、胃体、胃窦及多部位4组;组织分型分为腺癌及非腺癌组;腺癌浸润深度分粘膜及粘膜下层、肌层及浆膜层三组,另外2例浸润深度不能判定者分析中弃去;腺癌病理分化程度分为高~中及低分化二组;淋巴结转移分为有无二组;结果显示粘膜及粘膜下层浸润组阳性率明显低于肌层浸润及浆膜层浸润组( 33.33%VS.81.25%&75.93%,p=0.020) ,高一中分化组明显低于低分化组(62.50%VS.82.05%,p=0.053),表4。表4survi vi n表达相关因素分析发生部位N =96胃底贲门胃体胃窦多部位组织分型N =938腺癌非腺癌16222635496139124672.72%0.735’62.86%74.29%75.oo%69.74%0.36960.00%腺癌分化N =78高、中低251562.50%O .05331782.05%腺癌浸润N =78粘膜及粘膜下层固有肌层浆膜层3633.33%0.02013381.25%401375.93%淋巴结转移N =96F—__二生——————兰L.!!’ Fi sher检验有331668.09%0.771ZQ:墅墅82例鳞癌,1例类癌未予分析17 五.Survi vi n基因表达的多冈豢分析运用Logi sti c回归对survi vi n基冈表达与胃腺癌浸润深度、病理分化程度及有无淋巴结转移等进行多冈素分析得表5,从表中可以看出survi vi n基因表达仅与胃腺癌浸润深度有关( p<0.05) ,而与腺癌病理分化程度及有无淋巴结转移无关( p>0.05) 。表5survi vi n表达多因素分析因素BS.E.P值O R浸润深度一0.791 10.3700O ,0325O .4533淋巴结转移一O .72070.55170.19140.4863分化程度0.7332O .5842O .1 8592.1 657六.胃癌组织中P53基因的表达96例中39例见p53基因表达,阳性率为40.6%,阳性程度0、1、2、3及4分别占总数的59.4%、14.6%、5.2%、6.3%及14.6%,具体情况见表6及图9。P53基因表达阳性染色主要定位于肿瘤细胞核中,为淡黄至棕黄色颗粒,见( 图10~11、。 遘! 芷塑羹魈查星蕉生艘壅垄项目程度病例数掏成比躐9P53藻因在臀癌缀织中阳髋袭达分布19 豳10P53阳性( 腺癌,细胞核糟色,400X)图11P53阳性( 低分他腺癌,细胞梭着色,400X) 七.黔3基因表达的耀关因素分析应用Pearsonx2检验及Fi sher检验分析P53基因表逸与胃瘸发生部位、组织分羹、浸濑深度、痿理分纯程发及鸯无港爨缝转移阕夔关系,羧P53基因表达分表达、不表达二组,其中不袭达为0级,表达包括1、2、3及4级;发生部位劳为霄赢鼗门、跨涔、褥窦及多部位4组;缀缓分鍪分必豫癌及菲腺绱缰;豫癌浸润深度分粘膜及粘膜下层、湖有肌层及浆膜层三组,另外2例浸润深度不能判定者分析中弃去{腺癌精理分化程度分为高~中及低分化二组;淋巴结转移分为有笼二组;从表中可以麓出P53基因憋表达与浸溺深度、瘸理分化程度及有笼港巴缩转移间无明驻相关性( p》0.05,寝7) 。表7p53表达褶关因素分析发嶷部位N =96胃底贲门髯体胃寞多都篷l Ol 重16圭112519347.62%0.236+30。56%45.71%25。∞%组织分型N =938艨癌非腺癌33毒54l 。98%。0.53151033.33%豫痿努德N =78商、中低1525∞37.50%0.3781847.37%腺瘸浸润N =78嵇簇及耪貘下髹固有肌层浆膜层3537.50%0.39951033.33%233241.07%淋巴结转移N =96-—————蔓乙———一一.墼.一82铡鳞癌,1镄类瘫寒予分掇有193039.58%0.769垫丝:主墨墅。Fi sher检骏 八。霉癌缀织中survi vi n与P53基因袭达的相关热我们对survi vi n基因表达与p53基因表达的相关性进行了评价,方法为计算脚值坩欺划圳为脚” 掣焉竽濮中州黼莳格权熏,Poi j 为第i j 格实际一致比,Pei j 为第i j 格期望一致比。舆体情况见表8,Kappa值为0.067( Kappa<0.2提示二者一致性不商) ,表明二者之间无明显糯关性。表8survi vi n基医表达与p53相关性九。预后评价所有瘸例均谶行术衙五年随访(包括术衙治疗情况),其中92例随访完整(51倒术压5年内死予霉癌,4l 倒活瀵5年) ,4铡失游( 包据1铡寒螽1.5年死手心脏病) ,失访率3.9%,;30例术后接受化疗( 5一FU +M M C,l 码疗程不等) ,未化疗12爨,6l 铡治疗不详。采用Kapl an-M ei er绘制生存瞌线,图12为总体生存曲线,图13为按survi vi n基鬻逶否表达分缀生存褥线。总体五年生存率为48.1%,survi vi n阳性组及阴性组五年生存率分别为42。93%2乏52。93%,Log Rank捡验=0.4186;从翻13霹以看出survi vi n基因表达及不表达二组嫩存曲线间在瘸程早期无差异,随访2年后二照线呈分褒趋势。 圈12慧体生存蘧缓圈13黝fvi vi n基因鬻性缓( 红毪) 、戮往组( 绿色) 生存赫缝 讨论近年来,关于survi vi n基因与恶性肿瘤发生、预后及基因水平的治疗之间关系的研究迅速成为国内外关注热点口}2” 。鉴于其别于其它hl AP的分布模式:广泛存在于各种恶性肿瘤细胞中,而在正常成人组织中不表达,研究者正试图阐明其在恶性肿瘤的早期诊断、预后的预测及基凼水平的治疗上的实用价值。在人和鼠的胚胎及, qffJ L期,survi vi n基因表达丰富12】,而在IF常成人组织中几乎未检测到survi vi n基冈的表达[ 231,。几乎所有的恶性肿瘤均过度表达survi vi n m RN A及蛋白质【26≈71,survi vi n基因在肿瘤组织中重新激活的机理目前尚不明确。己有不少研究报道survi vi n基因在胃癌中的表达:Lu[ 2] 在174例行胃癌根治术患者术后胃癌组织中发现survi vi n基因表达率为34.5%( 60/174) ,而在癌旁正常组织中无表达。Chi ouDo] 发现人及小鼠正常胃粘膜上皮细胞表达survi vi n m RN A及蛋白,其中主细胞、壁细胞的胞核及胞浆均见表达,而且胃粘膜上皮比胃微虹管—卜皮表达率更高。Yu【列发现胃癌组织中survi vi n m RN A阳性率为68%,蛋白表达率为62.5%;正常胃粘膜组织m RN A及相关蛋白均无表达,而癌旁正常组织survi vi l /m RN A阳性率为22%,survi vi n蛋白表达率为12.5%;进一步研究发现胃癌患者直系亲属正常胃组织中survi vi n m RN A及蛋白表达率分别为为27%和20%。Yu从上述数值分析认为survi vi n m RN A表达率高于蛋白,但二者之问存在连续相关性。Yang XYIl ” 利用RT—PCR对胃癌组织及正常胃粘膜组织进行survi vi n基因序列分析发现,胃癌组织高表达survi vi n一4A,其硷基序列与survj vi n完全相同;而正常胃粘膜组织高表达survi vi n一1B,其序列中只有2个外显子,第3个外显子缺失。本实验中胃癌旁正常组织中无survi vi n基因表达支持这一观点,即癌旁正常组织中survi vi n基因的高表达为该基因的变异体。ram m l 28] 研究发现在正常人胃粘膜组织中survi vi n m RN A弱表达,蛋白质水平无表达;胃癌组织及癌旁正常组织高表达survi vi n m RN A及蛋白,但胃癌组织的表达比癌旁组织更强烈:而Cap,dse一3的表达情况与survi vi n正好相反,说明survi vi n作用与凋亡途径的下游,抑制Capase一3的活性。多项体外研究12” 0J 显示胃泌素通过上调抗凋亡基因survi vi n,bcl 一2的表达而抑制细胞凋亡,与胃癌的发生有关。本实验中胃癌组织survi vi n基因阳性表达率为70.8%,表达率与国外研究相似:癌旁『F常组织未表达该基因,而上述国外部分研究[1037I发现癌旁组织甚至 正常胃粘膜弱表达survi vi n基凶,可能有以FN 素:( 1) SU l l vi vi nm RN A表达率高于survi vi l l 蛋白;( 2) survivi n变异体的作用⋯' ” 1。stl rv] vi n基因的表达与肿瘤预后uJ 能存在一定关系:Sere] a1321分析144例结肠癌患者发现survi vi n阳性患者术后血年生存率为53%,显著低于survi vi n阴性患者的77.7%,故认为survi vi n为预后不良的独立危险因素。hdi da[ 191在222例B细胞型淋巴瘤中发现survi vi n阳性组与阴性组五年生存率有显著差异( 阳性组VS.阴性组,40%VS.54%,p-0.02) 。O kada[垃l 发现胃癌组织中细胞核及细胞浆均过度表达survi vi n基因,其中细胞核中表达率为82%,经多变量分析确定为一独立预后因子,与预后呈正相关,其表达率随年龄增长及血管转移而F降,为预后良好标志;Kap] an M ei er生存曲线也有差异;细胞浆中表达率为89%,与预后无关。本文发现survi vi n基因表达均定位于细胞浆,而细胞核中无表达,考虑白种人与黄种人之间的基凶表达差异可能。Kri eg[151发现胃癌组织中过度表达survi vi n基因及其二种变异体:△ EX3及--2B,但以survi vi n为主,比较不同临床分期表达率发现survi vi n及△ EX3表达率不随临床分期改变,只有~2B表达率随分期进展而下降,故Kri eg认为一2B为survi vi n拮抗因子,可抑制其抗凋亡能力。Lu【2】认为survi vi n基因表达与胃癌N 分期呈负相关,而与病理分化及T分期均无关;Yu发现survi vi n基因的表达与胃癌病理分化及淋巴结转移均无关;国内部分研究【l 叫发现survi vi n基因表达与肿瘤分化程度及TN M 分期有关,故认为survi vi n基因表达与肿瘤预后有关,阳性表达提示预后不良;但国内外绝大多数研究均未进行生存分析,而仅依据组织分化程度及临床分期等指标间接推测预后。本文详细调阅每例研究对象的手术记录及病理档案,包括肿瘤发生部位、浸润深度、病理组织分型、分化程度、有无淋巴结转移。X 2检验显示survi vi n基因表达与胃腺癌分化程度、浸润深度相关,粘膜及粘膜下层浸润组阳性率明显低于固有肌层浸润及浆膜层浸润组( 33.33%VS 81.25%& 75.93%,p<0.05) ,高~中分化组明显低于低分化组( 62.50%VS 82.05%,p-0,053) :但Logi Sti c回归对survi vi n基因表达与上述因素进行多因素分析发现该基因表达仅与胃癌浸渊深度有关( p<0.05) ,而与病理分化程度及有无淋巴结转移无关( p>O .05) 。本文研究对象均进行术后五年以上随访,生存分析采用Kapl an—M ei er曲线,该方法统计累计生存率,对二组生存率进行连续性比较,而非某一点的差异,故所得出的结果更具可靠性。结果68例survi vi n阳性表达的病例五年生存率 为42.93%,低于28例survi vi n阴性组五年生存率( 52.93%) ,但统计学无差异(口>O .05),生存曲线比较显示两组在随访早期差异无显著性,但在大约术后年二者显示出差异,这可能与进入本研究的样本量偏小有关,有必要扩大样本量,从而进一步观察二组生存率之间的差异。Survi vi n基因与p53是否存在相关性也已有探讨。p53基因位于17p13.1,编码分子量53000核磷蛋白,为一转录因子,作为Gl 期DN A损伤“ 检查点” ,当DN A受损,p53表达增加,复制停止,DN A修复,如修复失败,则导致凋亡【331。P53可因病毒癌基因结合、点突变、缺失、重排失活而失去抑癌作用,促进恶变。突变型p53在大多数肿瘤中表达上调,而在正常组织中不表达,目前多认为p53基因与恶性肿瘤预后无关,本文也有类似发现。Kora[8】在74例乳腺癌组中发现survi vi n基因表达与p53有关,但Tanaka[7]在乳腺癌组中,survi vi n与p53表达无关。本文中发现survi vi n基因在胃癌组织中的表达与p53基因无明显相关性。survi vi n基因和p53基因分别作用与细胞凋亡的不同环节04铘】1.突变型p53基因作用与细胞凋亡途径的上游,抑制Capase-9的活性;survi vi n作用与凋亡途径的下游,抑制Capase一3的活性。本文结果提示survi vi n基因表达与p53基因无明显相关性,也表明二者作用途径的差异。本文发现在胃癌中survi vi n基因过度表达,提示在肿瘤起始阶段survi vi n基因被激活,其与p53基因表达无明显相关性则表明它们分别抑制细胞凋亡的不同环节。Survi vi n基因是否与肿瘤预后有关,国内外观点不一,本文中发现其与胃癌浸润深度密切相关,与胃癌分化程度有一定相关性,但与有无淋巴结转移无明显相关性,阳性组与阴性组生存曲线在随访后期渐显差异。至于国外个案报道中发现细胞核中表达survi vi n基因,可能为survi vi n基因变异体,本文无相关发现,值得进一步探讨。由于进入本研究的样本量偏小,实验标本来源于大体蜡块,不能行PCR检测m RN A,加之时间有限,部分样本未到达研究终点,故所得出的结论可能存在一定程度的偏态。如能在今后的研究中加大样本量,延长随访时间直至终点,再加测新鲜标本中survi vi n m RN A,则其结论更具可信度。入选本研究的样本均为根治术患者,可保证较相似的起点和较充裕的随访时间,但不可避免造成选择性偏倚,拟进一步探讨survi vi n基因在未接受根治术者中的表达。 本研究提示结论1.survi vi n基因在胃癌组织中高表达,而癌旁正常组织不表达:癌组织中表达定位于细胞浆,『面细胞核未见表达。2.survi vi n基因在胃癌中的表达与腺癌浸润深度密切相关,与病理分级有一定相关性,而与组织分型及有无淋巴结转移均无明显相关性。3.survi vi n基因在胃癌中的表达与p53基因无关。4· survi vi n基因在胃癌中的表达与胃癌预后在病程早期差异不明显,而后期渐显差异。 参考文献1.萧树东主编。江绍基胃肠病学。上海:上海科技出版社,20012.LuCD,Al ti eri D C,Tani gaw a N ,et a1.Exepressi onof a novelanti -apoptosi s geneapoptosi s andp53 accum ul ati on i nsurvi vi n correl ated、Ⅳi th tum orcel lgastri ccarci nom a.CancerResearch,1998;58(9):1808—18123,王梅,王冰,王晓丽等。凋亡相关基因survi vi n在子宫颈癌组织中的表达及其与bel 一2,p53基因表达相关性的初步研究。中华妇产科杂志,2001;36(9):546—5484.Am brosi ni G,Adi da C,Al ti eriD C,et a1.A novel anti —apoptosi s gene,survi vi n,expressedi n cancer andl ym phorna.N ature M edi ci ne.1997;3(8):917—9215.Adi daC,Crotty PL,M cGrafl a J ,eta1.D evel opm ental l y regul atedexpressi onof thecancer anti -apoptosi s gene survi vi n i n hum an and m ouse di fferenti ati on.Am eri can J ournal 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致谢首先阳我的导师王吉耀教授和陈世耀副教授致以深深的谢意,是他们给予了我这次难得的学习机会,无论是课题的最初设计、实验过程,还是最后的完成工作,他们都倾注了大最的心血。三年来,在一位导师的严格要求和热心帮助下,我的科研能力以及临床技能均取得了长足的进步,在此向他们再次表示最诚挚的:位导师严谨的治学态度、一丝不苟的医疗作风、精湛的医术以及诲人不倦的精神将使我获益终生,更是我毕生学习的榜样,谨让我向他们表示由衷的敬谢意。意。感谢朱畴文副教授和刘天舒博士在论文完成过程中的帮助。特别感谢我的工作单位安徽省铜陵市人民医院的各级领导给了我这次继续升造的机会,二年学业的顺利完成与他们的关心和支持密不可分。感谢中山医院病理科主任谭云山教授为本实验提供了实验场所和基本仪器设备,更要感谢技术室阿克苏老师和诊断室侯英勇博士,感谢她们在实验过程及读片中给予的极大帮助,另外要感谢资料室小马在蜡块查找中给予的极大支持。衷心感谢中山医院消化科及内镜中心全体老师三年来对我的支持和鼓励,他们的言传身教和手把手的指导使我终生难忘。感谢中山医院消化科周莹群硕士在统计分析中给予的帮助。感谢中山医院中心实验室周老师在摄片中给予的极大方便。最后,感谢我的父母和我的妻子,是他们的关爱和支持,使我得以顺利完成三年的硕士学业。感谢所有帮助过我的人。 综述survi vi n基因在恶性肿瘤中的表达恶瞧鼬瘸雏发生、发震与缨照凋之密切耀关,关{二凋亡接关纂因p53稿bcl · 2国内矫均做了大量静研究,证实了其与肿瘤的稠关性。Survi vi n基因是1997年新发现的一个抗凋亡麟N t” ,其蛋自表达产物为一新的抗凋亡阂子,是凋‘ 蛋白抑制因予( 1AP) 家族中一员,基于其独特的结构、特殊的组织分布及明鑫的抗凌亡终斓蠢弓|超关注,本文羲稳关蘩圜国内夕}磷究迸震截一综述。survi vi n裁因1.Survi vi n基因的结构及染色体定位Survi vi n基因定经予17q25染佼傣,基毽全长431bp,编鼹一静叛黪人抟缨缒凋亡掷制蛋白( hl AP) ,是抑制缀胞凋亡的重嚣成分,抑制凋亡的作用远远超过bcl .2家族,是迄今为止发现的最小的hl AP鬣白,由142个氨基酸组成,含有一个N 末端的杆状瘸毒掬亡抑制缀白重复区序列( BIR) 医,但没有环攒状结梅。2.Survi vi n基因在不同组织中的表达生理状态下,在成人除子宫内膜组织.胎盘和胸腺组织中发现存在不同程度约survi vi n纂因表达辨,太多数组织均溅不到survi vi n基因表达【l 】,这耱分礞模式与其他IAP蛋白不同,其他IAP蛋自在生理情况下广泛分布在成人各种组织中,不同组织仅仅表现为表达水平的差别121。正常组织鼹有高度增殖指数的细胞域,如皮肤基底层的角质形成细胞、肠腺窝上皮细胞和班常骨髓缀织,均未梭测到survi vi a麓毽表达。程获,在发育至l _喜~21弱菸躲缀缀静弩小镣、瓣骧逡、簸腺、子宫内膜腺、表皮、胸腺髓质、脊索神经元均测得有survi vi n撼因的显著表达I 31。最近,J askol l l 4J 研究发现,在下颌腺胚胎发育过程中,survi vi n作为一种前生存园子,垂缨瓣浆自缨鼹梭翳篷可滏启动缨蕤送入缨熬蠲期,静翻缫蕤翡凝亡,跌瑟保护胚胎颈下腺缀魍,以利于腺体j F常发育,因此可以认为,survi vi n摹斟在胚胎组织中的表达有利于组织器官的正常发育。研究显示,绝大多数癌组织存在survi vi n裘达,不同癌缀织表达阳性率不同,如麟艨癌阳性率76。9%一88%曩毳藤癌鬻髓率70.7%16。l ,零癌阳瞧率30~89%18+-121,富颈缓69.5%【” 1,箨手瘸阳性率70%【14l 。3.survi vi n与细胞凋亡已知缀貔蠲亡有二条主要途径:一是TN F受{本家族残爨( 磐CD95) 参写楚通过Caspase-8( 半髋鬣酸酶一8) 潘化的途径,称外源性凋亡途径;二是细胞色 素c参与的通过Caspase.9活化的途径,称内源性凋亡途径。二条途径最后均通过激活下游效应Caspase.3和Caspase.7使细胞发生凋亡。Fas和Bax为凋亡诱导基因,-可以分别诱导上述二条途径的细胞凋亡。为探对survi vi n抑制调亡的确切机制,Tam m l l 51首先以含有Bax基因的质粒转染人293细胞,结果显示应用DAPI染色的凋亡细胞较币常增加7倍。随后以survi vi n基因与Bax基因同时转染,凋亡细胞较Bax单独转染减少l /3。应用Fas基冈与survi vi n基因共转染实验也获得类似的结果,survi vi n对凋亡的抑制大于1/2。免疫印迹技术显示,survi vi n的共转染并不影响293细胞对Bax和Fas蛋白的表达,提示survi vi n作用于凋亡通路的下游。将survi vi n蛋白分别与活化和非活...

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