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不同方法对血管平滑肌细胞表型特性影响的实验研究【精品文档】

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,941里竺竺竺翌!竺竺!!竺!!竺竺!!兰竺:!竺竺!竺竺!竺!!竺!竺竺!竺!!!:竺!:竺如aer2013,V01.11,N o.10The research of di fferent m ethods on thephenotypecharacteri sti cs ofvascul ar sm oothm uscl e cel l s尚松安马占龙陈相汛安艳丽丁洁滕皋军基金项目:国家自然科学基金面上项目( 项目编号:81071193)作者单位:210009南京市,江苏省分子影像与功能影像重点实验室,东南大学附属中大医院放射科通讯作者:马占龙,E-m ai l :m azhanl ong@ 126.C01【摘要】目的通过两种分离方法体外获取血管平滑肌细胞( VSM Cs) ,比较细胞表型差异及生物学特E,为血管性疾病研究提供精确实验基础。方法分别采用组织块法及酶消化法获取SD大鼠胸主动脉’ SM Cs,分为组织块组与酶消化组。倒置显微镜、结晶紫染色观察形态学改变并定量分析;M Tr比色法及ransw el l 细胞迁移实验分别检测分析细胞增殖与迁移活性;流式细胞周期测定细胞周期分布;细胞免疫荧光g色鉴定VSM Cs并测定分析收缩型标记蛋白理一平滑肌肌动蛋白( SM A) 以及合成型标记蛋白平滑肌胚胎型Ⅲ球蛋白重链( SM em b) 、原肌球蛋白-4( TPM 一4) 表达量的变化。结果两组细胞SM A细胞免疫荧光染色阳性§ ≥95%,细胞呈现谷峰状结构生长。组织块组与酶消化组两组细胞长径径值分别为( 95.10± 16.23) “ m 和114.67± 15.92)斗m 。与酶消化组相比,组织块组细胞增殖及迁移活性分别增加23.04%和1.54倍(P<0.05),S+,2期所占比例增加49.68%( P<0.05) ,SM A蛋白表达量下降( P<O .05) ,SM em b及TPM -4蛋白表达均增加( P<.05) 。结论组织块法获取细胞多以合成表型为主,酶消化法则主要呈收缩表型。伴随细胞形态学、增殖及迁}活性、表型特异性蛋白表达等不同改变,两种细胞获取方法可为不同目的研究提供精确的体外模型。【关键词】血管平滑肌细胞;表型转化;细胞培养doi :10.3969/j .i ssn.1672—5301.2013.10.017中图分类号Q 95—93;R543文献标识码A文章编号1672—5301( 2013) 10—0794-04Ire research of di fferent m ethods on thephenotype characteri sti cs of vascul ar sm ooth m uscl e cel l sH AN GSong- an,M A Zhan- l ong,CH ENXi ang- xun,et a1.D epartm ent of Radi ol ogy,J i a, 垮u Key Laboratory ofrol ecul ar如l q咖皤andFuncti onalIm pi ng,Departm ent of Radi ol o彰,Zho, , g如Hospi tal ofSoutheastUni versi 秒,' anj i ng 210009,Chi na' orrespondi ngauthor:M aZhtm - l ong,E—m ai l :m azhardong@ 126.com[ Abstract] O M ecti veTo obtai n the v鹊cul ar sm ooth m uscl e cel l s( VSM Cs) w i th t w o i sol ati on m eth-ds andcom parethecel l s’ bi ol ogi calbasi s for the research of vascul ar di sease.M ethodscharacteri sti cs andphenotypi e di fferences,provi di ngne pri m ary and subcul ture of VSM Cs from SDapreci se experi —rentali ts w ere doneby enzym ati cdi spersi onand ti ssueexpl ants.respecti vel y.neVSM Cs w ere observedusi ngobservati on andquanti tati ve anal ysi s.nefi rdpassageeeH s vi abi l i tyandm i grati onw ere detectedby M 订assayand trsnsw eHassay,respecti vel y.Im —m nofl uorescencestai ni ngfor contracti l e m arker a—sm ooth m uscl e acfi n( SM A) and syntheti cm arkers non—m scl e M H Ci soform —B( SM em b) ,Tropem yosi n一4( TPM 一4) w ere perform edfor VSM Cs i denti fi cati on anduanti tati veanal ysi s.Resul tsw ertedm i croscopeandcrystalvi ol etstai ni ngform orphol ogi cal7rhepost-confl uentcel l s exhi bi ted the“ hi l l andval l ey” grow th patternof theqOgroupsof cul tured VSM Cs.M ore than 95%of ceH s w ere bothposi ti vel ystai nedbyi m m unofl uorescence。si ni ngforSM A.Com paredw i th the enzym ati c di spersi on group,theceH s of the ti ssue expl ants grouphad ai gni fi cant m orphol ogi cal al terati on,w i ththepol ygonal shape(P<0.05),tl Ie vi abi l i tyand m obi l i ty of VSM Csm reased 23.04%and 1.54 ti m es,respecti vel y(P(O .05).The expressi onof both SM em b andⅡ' M 一4pro—万方数据 中国心血管病研究2013年10月第11卷第10期Chi nese J ournal ofCardi ovascul arResearch,O ctober2013,V01.11,N o.10tei ns i ncreased w hi k of SM Aprotei n decreased,si gni fi cantl y(P<0.05).Concl usi onTi ssueexpl antsforVSM Cs i s si ven pri ori tytosyntheti c phenotype,w hi l etheenzym e di gesti oni sm ai nl ycontracti ve phenotype,al ongw i th thecel lm orphol ogy,vi abi l i tyandm i grati on,andphenotypi cspeci fi ci typrotei nsexpressi onchange di fferentl y,thet w o m ethods Canprovi deaccurate m odel s i n vi tro for di fferent research purpose.[ Key w ordslVascul ar sm ooth m uscl ecel l ;Phenotype m odul ati on;Cel l cuhure血管平滑肌细胞( vascul arcel l s,VSM Cs) 是再狭窄、动脉粥样硬化、高血压等一系列血管性疾病的重要参与细胞。在疾病发生发展过程中,其由收缩表型向合成表型的转化被认为是一类重要的分子事伊-】,伴随形态学的改变、增殖迁移活性的增加以及表型相关特异性标记蛋白的表达变化。体外培养VSM Cs是近年发展得较为可靠的研究技术,分离方法多以组织块法与酶消化法为主【z-5]。但对两种培养方法所获得的VSM Cs生物特性探讨较为少见,针对特定分离方法的应用范围也缺少一定依据可循。本研究通过以上两种方法体外获取VSM Cs,对细胞表型变化及生物学特性进行比较分析,旨在为相关实验研究提供更精确的材料基础。1材料与方法1.1实验材料及主要试剂清洁级SD大鼠,体重150~200 g,雄性,购自上海实验动物中心。DM EM /F12培养基( G IBCO 公司) ;胎牛血清( FBS) ( H y—cl one公司) ;Transw el l 小室、胰蛋白酶、Ⅱ型胶原酶、噻唑蓝( M TD试剂盒、结晶紫染色液、47,6一二脒基一2一苯基吲哚( DAPI) ( Si gm a公司) ;小鼠抗大鼠d一平滑肌肌动蛋白( SM A) 单克隆抗体、小鼠抗大鼠平滑肌胚胎型肌球蛋白重链( SM em b) 单克隆抗体、兔抗大鼠原肌球蛋白4( 11PM 一4) 单克隆抗体( ABCAM 公司) ;羊抗小鼠四甲基异硫氰酸罗丹明四甲基异硫氰酸( TRITC) 荧光标记二抗、羊抗兔异硫氰酸荧光素( FITC) 荧光标记二抗( Abm art公司) ;细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒( 上海碧云天公司)。VSM Cs原代获取及培养1.2.1组织块法2只SD大鼠10%水合氯醛腹腔麻醉后浸泡在75%乙醇5 111i n,移入超净工作台。无菌盒盖上迅速取出胸主动脉,纵向剪开胸主动脉,镊子来回刮除内膜层,剥离血管中膜;将剥离的血管中膜用眼科剪剪碎,碎片大小为1 m m × l左右。将血管碎片均匀接种于25 IIl l 培养瓶,翻转湿润,然后贴壁侧向上,小块相互间间距以0.5 em为宜。待组织贴壁后置37℃、5%C02培养箱(The瑚o)3-5 h,使小块微干涸,然后轻轻翻转培养sm oothm uscl e1.2nl l Tl795瓶令贴壁侧向下,让培养液慢慢覆盖于贴壁侧组织小块,5%CO ,培养箱37℃静置培养。1.2.2酶消化法2只SD大鼠用上述方法将血管中膜碎片离心后弃去上清,加入2原酶消化液,37℃消化4—6 h,吸管吹打后镜下观察血管可被吹成小细胞团和多个单细胞,此时立即加入含20%FBS的DM EM /F12培养液终止消化。离心弃上清,用上述培养液重悬细胞,接种于25 l nl培养瓶,5%CO :培养箱37℃培养。上述两种细胞胰酶消化传代至第二、三代时即可行本实验。VSM Cs形态学观察及结晶紫染色分析两组原代及第三代细胞于48 h、5察并拍照。待两组第三代细胞汇合至80%,4%多聚甲醛固定后结晶紫染色液室温染色,充分洗涤后倒置显微镜(Axi overr,x200)观察和拍照。使用Im age—Pro PIus 6.0( IPP 6.O ) 软件测量两组细胞长径径值并统计分析形态学变化。1.4细胞生长曲线测定及增殖活性测定将两组第二代细胞制成单个细胞悬液,接种于96孔板( 1x1叶孔),置于37 oC、5%CO ,细胞培养箱内孵育。使用M TY比色法,采用酶标仪( Therm o) 于490 am 波长处测定各孔的光密度值( D990 nm ) 并记录结果,每日测6孔,连续7 d,设立平行对照孔并调零。以时间为横坐标,吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。两组第三代VSM Cs血清饥饿法同步化12 h后,按照上述方法行M Tr测定光吸收值,记录并分析VSM Cs增殖活性改变。1.5细胞迁移活性测定取两组第三代细胞制成单个细胞悬液,接种于24孔板Trasw el l 小室( 1x104/孔) ,加入无FBS的DM EM /F12培养液200恤l ,下室加入20%FBS的DM EM /F12培养液600仙l ,5%CO :培养箱37℃培养24 h,细胞固定后DAPI染色,倒置荧光显微镜下拍照并计数分析。VSM Cs流式细胞周期测定胰酶消化后,收集两组细胞固定于70%冰乙醇,置4℃过夜,碘化吡啶Q D避光染色,用流式细胞仪在激发波长488啪波长处检测红色荧光,同时检测光散射情况。进行细胞DN A含量分析和光散射分析。IIl l 0.1%Ⅱ型胶1.3d、7 d倒置显微镜观1.6万方数据 796中国心血管病研究2013年10月第11卷第10期Chi nese J ournal ofCardi ovascul arResearch,O ctober2013,V01.11,N o.101.7VSM Cs免疫细胞荧光鉴定及表型相关特异性蛋白表达测定分析待两组第三代细胞生长汇合80%~90%,以鼠抗SM A( 1:500) 、SM em b( 1:500) 抗体及兔抗TPM 一4( 1:500) 抗体为一抗,同时设立空白对照组( 不加一抗) ,4 oC孵育过夜,荧光二抗羊抗小鼠TRITC—IgG ( 1:100) 、羊抗兔FITC—IgG ( 1:100) 避光室温孵育后D API染色,封片剂封片后于倒置荧光显微镜( O l ym pus,x200) 观察并拍照。使用IPP 6.0软件分别测定两组细胞的平均荧光光度值,并统计分析。1.8统计学方法使用SPSS 18.0统计软件进行处理。计量资料用互± s表示,两独立样本均数比较采用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。结果22.1定倒置显微镜观察,原代培养48 h后,组织块组可见细胞从血管片周围呈扇形长出,形态以扁平状多见,细胞分布相对密集;酶消化组细胞分布均匀,以长梭样形态为主,早期细胞密度相对较高。两组VSM Cs均为一个细胞核,呈椭圆形,位于细胞中央,可见多个核仁;当生长汇合至80%~90%时,细胞排列成束,部分重叠,表现为“ 谷峰状” 生长( 图1,B、E) ;SM A免疫细胞荧光检测呈阳性,胞膜及胞质着色,同时可见与细胞纵轴平行排列的肌丝,即平滑肌d肌动蛋白丝,阳性率≥95%( 图2,C) 。第二代vSM Cs传代贴壁后,两组细胞O ~72 h均呈对数生长,至72~96 h生长活性达到最高,96 h后活性开始下降,酶消化组对数期细胞生长速度比组织块组慢(图2,D)。组织块组细胞“ 谷峰状” 生长较为典型,细胞长径明显缩短,结晶紫染色观察可见胞核多处于分裂期( 图2,A、B) 。两组细胞长径测量结果显示,组织块组细胞长径比酶消化组缩短17.06%( P<0.05) ,细胞面积增加,处于相对高合成分泌状态。VSM Cs增殖、细胞周期分布及迁移活性测定VSM Cs鉴定、生长曲线绘制及形态学观察测2.2通过M rITr比色法测定发现,处于对数期生长细胞,组织块组与酶消化组细胞增殖活性分别为0.251±0.498和0.206± 0.174( 表1) ,组织块组增殖活性比酶消化组增加23.04%( P<O .05) 。流式细胞周期测定结果显示( 图3) ,酶消化组与组织块组S期所占比例分为( 8.20+0.35) %和( 15.28± 1.67) %,G2期所占比例分别为(10.19_+0.51)%和(12.23_+1.24)%,组织块组细胞周期S期+G 2期所占比例比酶消化组增加49.68%( P<0.05) ,细胞合成分裂增加。Tran—sw el l 细胞迁移实验对细胞迁移活性的测定结果表明,组织块组与酶消化组细胞迁移数量分别为( 2417_+155) 个和( 1571± 380) 个( 表1) ,组织块组细胞迁移数量明显多于酶消化组,约是酶消化组的1.54倍(P<0.05)。组织块组细胞与酶消化组相比具有较高的增殖与迁移活性。表1两组细胞长径、活性、迁移对比G± s)2.3收缩型及合成型标记蛋白鉴定及表达变化组织块组与酶消化组VSM Cs三种标记蛋白免疫染色均呈阳性( 图4,A~F) ,但细胞形态差异明显;两组VSM Cs收缩型及合成型标记蛋白的表达存在相反变化。免疫荧光定量测定显示,组织块组SM A表达量比酶消化组减少9.93%( P<O .05) ;SM em b及TPM 一4表达量分别增加10.99%、16.61%( P<O .05)( 图5) 。免疫荧光结果表明,酶消化组收缩型标记蛋白呈现相对高表达,组织块组则以合成型标记蛋白表达为主。3讨论在多种因素刺激作用下,处于中膜层的VSM Cs由收缩表型向合成表型转化,随后增殖迁移至新生¨墨蠹}JIL.。磕翮图3A、B为酶消化组与组织块组流式细胞周期图;C图为两组细胞周期( S期、G 2期、G 1期】分布。酶消化组与组织块组S期所占比例分为( 8.20+0.35) %、( 15.28土1.67) %,G2期所占比例分别为( 10.19+0.51) %、( 12.23±1.24) %,组织块组细胞周期中S期+G 2期所占比例高于酶消化组,细胞分裂增殖活性较高万方数据 中国心血管病研究2013年l O 月第1l 卷第l O 期(.' hi ne,P J ournal ofCardi ovascul arResearch,O ctober2013,V01.11,N o.10|Sg^Sm em b[ P*{图5两组细胞表型特异蛋白表达定量分析:与酶消化组比较。组织块组SM A表达量相比减少9.93%【P<0.05) ,SM em b及TPM 一4表达量分别增加10.99%、16.61%(P<0.05)内膜并分泌大量胞外基质,参与血管性疾病的主要病理过程【6,,] 。体外获取VSM Cs,能够对VSM Cs这一过程进行精确可控性研究。体外两种不同方法虽均能高效获取大量细胞,但其生物学特性并不完全相同。本实验研究结果显示,酶消化法所获VSM Cs能够较好地保持原有血管组织的某些特性,细胞形态多为长梭形,增殖及迁移活性处于较低状态,细胞周期多处于G 1期;组织块法获取的VSM Cs具有典型的高合成分泌特性,伴有增殖与迁移活性增加,形态以扁平状为主,S期+92期所占细胞周期比例增加,相对接近病理状态下的VSM Cs生物学特性。虽然酶消化法所获细胞不具备典型谷峰状生长,对数期细胞生长比较缓慢,增殖及迁移活性也相对处于低水平,且三种表型特异性蛋白表达量与组织块组细胞比较存在一定差异,但两种方法所获细胞SM A免疫荧光染色均呈阳性,为同一类细胞不同表型状态所致生物学特性差异。在原代培养过程中,组织块法早期细胞密度相对较低,分布欠均匀,原代培养时间较长;而酶消化法在一定程度上较易掌握,细胞分布均匀,利于细胞生长,能够明显缩短原代细胞培养时间。血管平滑肌细胞在机体不同的发育阶段,在生理或病理状态下的成熟机体,在结构上主要呈现两种形态——收缩表型及合成表型[8t,】。影响血管平滑肌细胞表型的因素很多,其中细胞培养方法的不同也会对平滑肌细胞表型产生影响。结合本实验结果可以证实:酶消化法由于酶的作用使细胞间失去连接,表型特异性蛋白的表达以收缩型蛋白表达为主,合成型蛋白的表达量相对处于低水平,此类细797胞多保持收缩表型;组织块法使细胞合成分泌能力显著升高,合成型特异蛋白表达量相对较大,而收缩型蛋白表达较少,此类细胞以合成表型为主。鉴于VSM Cs具有收缩型及合成型两种不同表型,且可在一定条件下相互转化[101,因此在血管性疾病的研究过程中,应根据不同的实验研究目的采取对应的控制条件来精确获取VSM Cs。组织块法所获细胞以合成型为主,较贴近血管形成早期及病理状态下的VSM Cs,可用于药物干预及治疗效果测定、血管组织工程学研究等领域;酶消化法所获细胞与正常生理状态下细胞特性相仿,可用于血管性疾病病理过程中VSM Cs基因表达调控、炎症因子刺激作用、传导调节通路及表型转化相关机制等方面的研究。( 本文图1,图2,图4见Ⅱ、Ⅲ页)4参考文献[ 1] O w ens G K,Kum ar M S,W am hof fBR.M ol ecul arregul ati onofvascul arsm oothm uscl ecel ldi fferenti ati oni ndevel opm entanddi sease.Physi olRev,2004,84:767- 801.[ 2] 马丽,刘苏健,邓勇志,等.大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养与鉴定.中国心血管病研究,2007,5:363—365.[ 3] 潘大彬,柯永胜,刘文洁,等.血小板衍生生长因子一BB通过转化生长因子一B信号系统调节大鼠血管平滑肌细胞内p21‘ W AFl 表达.中华心血管病杂志,2010,38:160—165.[ 4] 杨东伟,张清华,蒋知新.大鼠胸主动脉平滑肌细胞胶原酶解法培养与鉴定.中国现代医学杂志,2009,19:1333—1335.[ 5] 曲明娟,徐伟艳,王晓安,等.尼古丁对大鼠血管平滑肌细胞增殖和凋亡的影响.解剖学报,2011,42:215—219.[ 6] Curei o A,Torel l a D ,Indo塌C.M echani sm s of sm ooth m uscl e cel lprol i ferati onand endothel i alregenerati onafter vascul ari nj uryandstenti ng.Ci rc J ,2011,75:1287—1296.[7 JLacal l ey P,Regnaul tV,N i col ettiA.The Vascul ar Sm ooth M uscl eCel li n arteri alpathol ogy:acel lthatCan takeonm ul ti pl erol es,Cardi ovasc Res,2012,95:194—204.[ 8] Rensen SS,Doevendans PA,van_Eys G J .Regul ati on and char-aeteri sti esofvascul arsm ooth m uscl ecel lphenotypi edi versi ty.N etl lH eart J ,2007,15:100—108.[ 9] Rudi j anto A.Therol eofVasCul ar sm oothm uscl ecel l son thepathogenesi sof atheroscl em si s.Aeta M ed Indones,2007,39:86-93.[10]Sti ntzi ng S,O ckerM ,H arm er A,eta1.Di fferenti ati onpat—terni ngofVasCul arsm ooth m uscl e cel l s( vsm c) i natheroscl e—rosi s.Vi rchow s Arch,2009,455:171—185.(收稿日期:2013—06—08)万方数据 L{1同心血管病研究2013年10月第1I卷第10期Chi nese J o“ m dofCardi ovascul ar Research,ocfober 2013,y。2· ,,,舳· 加.I.不同方法对血管平滑肌细胞表型特性影响的实验研究( P794)|_.闲勰、、必图1倒置显微镜下两组细胞形态观察( × 200o A—C为组织块组细胞;D—F为酶消化组细胞。A、D为原代细胞第3d。A图见细胞由组织块边缘游出,以扁平状为主,D图细胞以长梭形为主,且细胞分布均匀:B、E为原代细胞第7d。可见” 谷一峰” 状生长,B图细胞较为扁平,E图细胞呈长梭形,” 谷一峰” 状生长较典型;C、F为第三代细胞,C图细胞扁平状结构更为突出,细胞长径缩短明显,F图则相反图2A、B分别为组织块组与酶消化组结晶紫染色。两图均可见细胞单个椭圆形胞核及多个核仁。A图细胞形态以扁平状为主。细胞长径较短,细胞面积增加,B图相反;C为细胞SM A免疫荧光染色鉴定,与细胞纵轴平行排列肌丝可见;D为两组细胞生长曲线。组织块组对数期细胞生长速度明显高于酶消化组( P<O .05).一移‘0.戆冁.—雠一 黔盔万方数据 图4A—C分别为组织块组三种标记蛋白SM A、Sm em b、TPM 一4荧光染色;D—F分别为酶消化组三种标记蛋白SM A、Sm em b、TPM 一4荧光染色。SM A以胞膜表达为主,Sm em b、TPM 一4以胞质多表达,A—C细胞亦呈扁平形态,D—F以长梭形多见导管射频消融A术对心房颤动左心重构的影响( P744)图3RFCA术前后M R变化A.患者术前房颤律时心尖四腔心切面示M R,测得RJ A为4.9 cm 2;B.同一患者术后3个月时RJ A仅为0.4 cm 2注:I{A:√i 心啊二氯乙酸盐对肺高压血管重构作用机制的研究( P798)::j摹,l碧慈瓢·、蕊图2- I各组肺组织H —E染色( x400倍)/海々:g万方数据 精品资料,你值得拥有!

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